膝痹通絡方通過調節MAPK-MEK信號通路延緩對白細胞介素1β誘導的關節軟骨細胞退變

宋奕， 丁道芳， 朱寅， 王星華

（1.蘇州市中西醫結合醫院，江蘇蘇州 215000；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心，上海 201203；3.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所，上海 201203）

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）好發于使用頻繁，且負重大、活動多的關節，如膝、髖、脊柱、踝等，其中又以膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）最為常見。根據最新的流行病學調查數據顯示，我國目前癥狀性KOA 的患病率為8.1%，這一比例意味著我國目前大約有1.1 億KOA 患者，而65 歲以上KOA 患病率甚至已達到50%[1]。KOA 的主要病理改變是軟骨的退行性變。正常情況下軟骨細胞外基質的合成和降解是一個動態平衡的過程，而在KOA 狀態，這一平衡被打破，最終導致軟骨細胞的退變和凋亡，細胞外基質的松散。有學者研究發現，關節腔的炎癥是導致這一平衡被打破的主要原因之一，且KOA 發病過程中的炎癥反應及軟骨退變都有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）- MAPK 激酶（MEK）信號通路參與。對于KOA 的治療，目前除了健康教育和功能鍛煉外，仍以藥物治療為主。膝痹通絡方是蘇州市中西醫結合醫院治療KOA 的經驗方，臨床取得較好療效，能顯著改善膝關節疼痛及活動度。炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）是KOA 炎癥反應中的關鍵因子，本研究通過以其誘導軟骨細胞退變模擬KOA 軟骨退變，觀察膝痹通絡方含藥血清對退變軟骨細胞的影響，并從MAPK-MEK 信號通路探討其作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物新生24 h 雌性SD 大鼠10 只，清潔級雌性3 月齡SD 大鼠20 只，體質量（200±20）g，購自上海實驗動物資源中心，動物質量合格證號：SCXK（滬2008-0016）。

1. 2藥物、試劑與儀器膝痹通絡方組成中藥（杜仲10 g，牛膝10 g，黃芪20 g，當歸10 g，川芎10 g，白芍10 g，獨活10 g，雞血藤30 g，秦艽6 g，木瓜10 g）由蘇州市中西醫結合醫院提供，為江陰江天藥業免煎顆粒劑；胎牛血清、H-DMEM培養基、胰蛋白酶（法國Biowest 公司）；IL-1β（美國RD 公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美國Sigma 公司）；PCR 試劑盒（美國Selleck 公司）；性別決定區Y框蛋白（SOX9）抗體、基質金屬蛋白酶13（MMP13）抗體、磷酸化原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（P-Raf1）抗體、Raf1 抗體、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK1）抗體、MEK1抗體、GAPDH 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）抗體（美國EarthOx 公司）。離心機（德國Sigma 公司）；多功能酶標儀（美國BioTek 公司）；CO2恒溫培養箱（美國Thermo Scientific 公司）；IX41 顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3軟骨細胞培養方法及免疫熒光鑒定采用上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心已成熟的軟骨細胞培養方法[2]。將10只新生24 h雌性SD 大鼠脫頸椎處死，取雙側肱骨頭處軟骨，清除殘留組織后剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 大小骨塊，在37 ℃細胞培養箱內用1 g/L 的Ⅱ型膠原酶消化1 h，收集消化后的細胞懸浮液，并重復3～4 次，懸浮液離心后收集細胞，細胞培養液重懸并接種細胞，隔日換液。取P1代細胞進行實驗。

細胞鑒定：以40 g/L多聚甲醛固定細胞10 min后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 次，磷酸鹽Tween20緩沖液（PBST）通透20～30 min，體積分數5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉浸泡1 h，加入Ⅱ型膠原抗體（稀釋度為1∶200），4 ℃孵育過夜。再用PBS清洗3 次，加入FITC 標記的抗小鼠二抗（稀釋度1∶200），室溫避光孵育1 h，PBST 清洗3次后加入DAPI 染液（10 μg/L），5 min 后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.4膝痹通絡方含藥血清制備膝痹通絡方中藥顆粒劑混合后用開水沖泡，充分攪拌溶解、冷卻，根據人-大鼠體表面積比值折算出大鼠口服劑量為10.86 g·kg-1·d-1，以5.43、10.86、21.72 g·kg-1·d-1的口服劑量分別設為低、中、高濃度組。將20 只清潔級雌性3 月齡SD 大鼠隨機分成4 組，其中正常組8只，高、中、低濃度中藥組各4只，每200 g體質量大鼠每日灌胃2 mL，高、中、低濃度中藥組大鼠分別對應灌胃高、中、低濃度膝痹通絡方，正常組每日灌胃等體積生理鹽水。每日灌服1 次，連續3 d。末次灌藥1 h后腹主動脈取血，取上層血清56 ℃滅活后過濾分裝，于4 ℃保存備用。

1.5細胞分組培養收集生長狀態良好的軟骨細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，以5 mL接種于直徑6 cm 培養皿，將細胞隨機分為5 組，即正常對照組、IL-1β 組、高濃度中藥組、中濃度中藥組和低濃度中藥組。正常對照組：加入正常大鼠血清培養；IL-1β組：加入正常大鼠血清和20 ng/mL IL-1β培養；高、中、低濃度中藥組：分別對應加入高、中、低濃度的膝痹通絡方含藥血清進行培養，并加入20 ng/mL IL-1β。培養24 h后，倒置顯微鏡（100 倍）下觀察軟骨細胞大小、密度與形態，同時提取細胞RNA 和蛋白進行定量聚合酶鏈反應（qPCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測。

1.6 qPCR法檢測軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4/5基因的表達細胞培養24 h 后，抽提軟骨細胞總RNA并進行濃度測定，取2 μg RNA 逆轉錄，進行qPCR 檢測。每個樣品設3 個復孔，重復3次。以GAPDH作為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因表達的相對變化，引物序列見表1。反應條件：95 ℃30 s，初步變性1 個循環；95 ℃5 s變性，60 ℃30 s 退火，重復40 個循環；72 ℃30 s延伸。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.7 Western Blot法檢測軟骨細胞SOX9、MMP13、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達細胞培養24 h 后進行細胞裂解提取蛋白，測定濃度，分裝，于-20 ℃冰箱保存備用。蛋白電泳、轉膜，溫封閉液浸泡1 h，加入上述一抗孵育過夜，洗膜后，再加入二抗溫孵育1 h，洗膜，化學發光法檢測并X 線膠片曝光顯影，應用ImageJ 軟件進行灰度值分析。

1.8統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差（x±s）表示，組間差異通過單因素方差分析并采用LSD-t法進行多重比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1軟骨細胞的免疫熒光染色鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞質經Ⅱ型膠原免疫熒光染色后發出鮮亮的紅色熒光（見圖1-a），為強陽性表現，證實為軟骨細胞，細胞核未著色，表明Ⅱ型膠原蛋白在細胞核內無表達。幾乎所有細胞經DAPI 染色后細胞核均發出藍色熒光（見圖1-b）。圖1-c 為圖1-a和圖1-b的疊加，絕大多數細胞表達Ⅱ型膠原蛋白，證明提取的軟骨細胞純度高。

圖1 軟骨細胞Ⅱ型膠原的免疫熒光染色Figure 1 Immunofluorescence staining results for typeⅡcollagen in chondrocytes

圖2 各組軟骨細胞形態比較（×100）Figure 2 Comparison of the morphological features of chondrocytes in various groups（×100）

圖3 各組軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達比較（±s）Figure 3 Comparison of the expression levels of MMP3，SOX9，A-CAN，ADAMTS4，ADAMTS5 genes in chondrocytes of various groups（±s）

2. 2各組軟骨細胞形態比較倒置顯微鏡下可見：正常對照組軟骨細胞呈三角形、多角形，形態飽滿，融合后呈“鋪路石”樣；與正常對照組比較，IL-1β組及各濃度中藥膝痹通絡方組軟骨細胞形態明顯細長、單薄，呈長梭形改變，呈明顯的退變形態，但各濃度中藥組軟骨細胞退變形態較IL-1β組減輕。見圖2。

2. 3各組軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達比較圖3 結果顯示：與正常對照組比較，IL-1β 組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），SOX9、A-CAN mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，各濃度中藥組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平明顯降低，SOX9、A-CAN mRNA 表達水平升高，其中，高濃度中藥組差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.4各組軟骨細胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1 蛋白表達比較圖4 結果顯示：與正常對照組比較，IL-1β 組軟骨細胞MMP13 蛋白表達，Raf1、MEK1磷酸化水平明顯升高，SOX9蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。與IL-1β 組比較，各濃度中藥組MMP13蛋白表達、Raf1、MEK1磷酸化水平明顯降低，SOX9 蛋白表達水平升高（均P＜0.05）。

圖4 各組軟骨細胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達比較（±s）Figure 4 Comparison of the expression levels of MMP13,SOX9,P-RAF1,Raf1,P-Mek1,and MEK1 proteins in chondrocytes of various groups（±s）

3 討論

3.1 KOA的中醫學認識膝關節骨性關節炎（KOA）屬于中醫學“痹證”范疇，歷代醫家對于其論述及治法各有特色。其雖病位在筋骨，但本在于腎。老齡患者肝腎漸虧，髓枯血虛，筋骨失于濡養而不復堅固，損傷或復感風、寒、濕、熱等外邪時疼痛發作，久病則筋脈攣縮，無力束骨，可引起關節不穩及屈伸不利癥狀。而血瘀則是機體衰退過程中潛在的病理因素，外傷勞損、氣候變化都可致瘀血痹阻，阻礙筋骨關節的潤養，加重關節的退化[3]。膝痹通絡方是蘇州市中西醫結合醫院骨科治療KOA 的經驗方，方中：杜仲、牛膝補肝腎、強筋骨；黃芪補氣健脾；當歸、川芎、白芍養血活血；獨活、雞血藤、秦艽、木瓜祛風除痹，舒筋通絡。全方共奏補益肝腎、活血祛瘀之功。

3.2 KOA的現代醫學認識現代醫學認為，KOA患者因為年齡增長及膝關節力線的改變，膝關節長期處于疲勞狀態，關節穩定性下降，軟骨和半月板存在物理性磨損。而近些年來，關節滑膜的炎癥所扮演的角色越來越得到重視，滑膜炎癥的進展程度可以直接反映KOA 的嚴重程度，也是KOA 發生、發展的獨立性危險因素[4-5]。有學者對只有癥狀而無影像學改變的KOA 患者進行關節鏡隨防，發現約50%的患者關節鏡下有局限性滑膜炎癥表現，且這些患者在1年之后，都出現了局部軟骨破壞的表現[6]。在關節退變的早期即有炎癥的參與，并伴隨軟骨細胞的退變、細胞外基質的破壞。當關節滑膜受到刺激，可誘發滑膜內血管增生擴張、滑膜細胞的活躍增生等一系列反應，并釋放大量炎癥因子，侵蝕關節內軟骨，軟骨在化學性侵蝕及物理性摩擦的惡性循環下，進行性磨損、變薄甚至缺如，致關節間隙變窄，軟骨下骨質硬化。研究發現，IL-1 是關鍵性炎性因子之一，也是炎癥發生的始動因素，可直接調節軟骨細胞MMPs的生成，抑制蛋白多糖及Ⅱ型膠原等軟骨基質的合成，促進軟骨細胞的退變及凋亡，直接導致軟骨的化學性損傷，加速骨關節炎的發生[7]。IL-1 又分IL-1α 和IL-1β 2 種亞型，其中IL-1β 是主要亞型，隨著KOA 的病情發展，關節內IL-1β可呈持續性增高，基于此，本研究采用IL-1β作為軟骨細胞退變的誘導因子，模擬KOA 患者體內軟骨退變模型。

MMPs是一個龐大的蛋白酶超家族，其家族成員能降解幾乎所有的細胞外基質，在膝關節，MMPs 可因IL-1 等炎癥因子刺激后，由軟骨細胞、滑膜細胞以及中性粒細胞產生，MMPs的過度表達，可加速軟骨細胞外基質的降解，導致關節內軟骨進行性破壞。在MMPs家族中，以MMP3和MMP13在KOA 的參與度最為突出。膝關節軟骨細胞外基質中最為主要的成分是Ⅱ型膠原，其次為蛋白多糖，MMP13 是所有MMPs 家族中降解Ⅱ型膠原蛋白能力最強的，而MMP3 對于A-CAN 又有較高的裂解活性，隨著細胞外基質的降解，軟骨的生物學特點發生改變，抗應力能力也大大下降，加速退變，因此，MMP3 和MMP13 是反映KOA 軟骨退變程度的重要標志物[8]。與MMPs 等經典蛋白酶相比，聚蛋白多糖酶家族（ADAMTSs）對KOA 的影響在近些年才逐漸受到重視，其中ADAMTS4 和ADAMTS5 是軟骨細胞外A-CAN 的主要降解酶。研究發現，敲除ADAMTS4和ADAMTS5基因的小鼠在誘導KOA 過程中，與正常小鼠相比，僅出現了輕度膝關節退變，特別是敲除ADAMTS5 基因后，小鼠軟骨缺損程度明顯輕于敲除ADAMTS4 基因及正常的小鼠[9-10]。SOX9 對軟骨細胞及細胞外基質的調節起著至關重要的作用，被稱為軟骨的“主調節因子”。SOX9 可同時調控Ⅱ型膠原及A-CAN 的表達促進軟骨細胞外基質的生成與修復，又可抑制ADAMTS4 和ADAMTS5 等聚蛋白酶以及MMPs 在KOA 早期的表達，可以說是KOA軟骨的保護器[11-12]。

3.3 MAPK-MEK信號通路在KOA中的作用IL-1等關節內炎癥因子還能誘發軟骨細胞中的一系列酶促反應，進一步加速軟骨細胞的退變，其中MAPKs 信號通路是參與骨關節炎中軟骨破壞最重要的通路之一[13]。MAPK-MEK 通路是MAPKs 家族中的經典通路，主要由Raf、MEK、ERK三級酶聯功能單位構成，當其依次被磷酸化激活后，可誘發下游更為廣泛的蛋白表達，在調節細胞生理應答過程中發揮重要作用。在膝關節中，上游的Ras活化可進一步激活Raf 蛋白，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進而活化ERK1和ERK2，最后下游的轉錄因子進入軟骨細胞核內參與細胞的增殖、分化、鈣化等一系列生理病理過程，大大改變軟骨細胞的內環境[14]。當IL-1、TNF-α等炎癥因子與軟骨細胞膜上的受體結合或機械應力刺激后，軟骨細胞內的MAPKs 信號通路被激活，引起MMPs大量表達，導致軟骨被快速破壞，此外，該信號通路還廣泛參與軟骨細胞的凋亡、肥大、鈣化等病理過程[15]。針對MAPK-MEK 信號通路的一些治療，在臨床和實驗中也被證實是有效的。Prasadam等[16]給KOA 大鼠關節腔注射透明質酸及UO126（MAPK-MEK 通路抑制劑），結果發現UO126 可明顯抑制軟骨細胞肥大相關蛋白（COL10 和RUNX2）及退變相關蛋白（ADAMTs5和MMP13）的表達，延緩軟骨細胞的退化，治療效果優于未治療組及單用透明質酸組。國內一些學者研究發現，電針、手法松解等中醫傳統醫學也可通過調節該通路，達到改善關節疼痛癥狀，延緩關節退化，以及減輕關節炎癥的目的[17-18]。

3.4膝痹通絡方治療KOA的機制探討膝痹通絡方為我院經驗方，臨床療效肯定。本研究從細胞分子生物學角度，對其治療機制進行了探索。本研究在軟骨細胞培養液中加入IL-1β，模擬軟骨細胞退變，顯微鏡下直觀可見細胞形態明顯發生改變，與正常組相比呈扁平、狹長的退化形態。進一步以qPCR 和Western Blot 法檢測相關基因及蛋白表達情況，發現MMPs、ADAMTs 等促軟骨細胞退變的蛋白酶水平明顯上升，而抑軟骨細胞退變的轉錄因子SOX9 及A-CAN 表達水平明顯下降，與既往研究[7]結果相符。而加入不同濃度膝痹通絡方含藥血清組的軟骨細胞雖也呈現退化狀態，但整體狀態優于IL-1β組。表明膝痹通絡方可一定程度抑制IL-1β 所致的軟骨細胞MMPs、ADAMTs 的過表達，亦可緩解IL-1β對SOX9、A-CAN 的抑制作用。

基于MAPK-MEK信號通路在KOA發病過程中的重要作用，本研究進一步觀察膝痹通絡方含藥血清對該信號通路的影響。MAPK-MEK 信號通路的活性主要取決于通路中相關磷酸化蛋白的水平，而非總蛋白含量。本研究中，軟骨細胞經IL-1β誘導后Raf1、MEK 磷酸化水平顯著增高，證實了IL-1β 可上調MAPK-MEK 信號通路的活性，而各濃度中藥組軟骨細胞Raf1 和MEK 磷酸化水平較IL-1β組明顯下降，提示膝痹通絡方含藥血清可抑制IL-1β 所誘導的MAPK-MEK 信號通路的過度活躍。

綜上所述，膝痹通絡方含藥血清可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞的退變，保護軟骨細胞，其具體機制可能是抑制了IL-1β 所致的MAPK-MEK 信號通路的過度活躍。但本實驗僅為體外實驗，軟骨細胞在體內和體外的生物學活性可能存在一定差異，因此需進一步通過動物體內實驗驗證本方的有效性和安全性，這也是本課題組下一步的研究計劃。