芪術抗癌方對肝癌細胞上皮間質化的影響

馮文杏， 胡銳， 孫新鋒， 韓志毅， 馬文峰， 張衛， 周小舟

（廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東深圳 518033）

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，異質性強，死亡率高。約90%與癌癥相關的死亡是由轉移性疾病而不是原發性腫瘤引起的[1-2]。侵襲性腫瘤前緣細胞多表現出一種去分化的形態，這種形態是由上皮標志物和細胞與細胞間連接的丟失引起的，并獲得間葉細胞標志物的表達[3-4]，這種細胞表型的轉變程序稱為上皮間質化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。上皮間質化與多種腫瘤功能相關，包括腫瘤的發生、惡性進展、腫瘤的干性、腫瘤細胞的遷移、侵入血管、轉移和對治療的抵抗等方面[5]。中醫學無“肝癌”病名，根據相關癥狀其隸屬于“鼓脹”“肝積”“肝脹”等范疇，在病因病機上存在正虛邪實的特點。基于這一特點，周小舟主任在臨床中運用芪術抗癌方治療肝癌獲得了良好的療效[6]，但其機制尚不明確。因此，本研究通過體外實驗探討芪術抗癌方對肝癌HepG2 細胞上皮間質化的影響，以期為其臨床應用提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株人肝癌細胞株HepG2購自武漢博士德公司。

1.2試劑與儀器轉化生長因子β1（TGF-β1）（美國R&D 公司）；E 鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N 鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、Vimentin 抗體、Snail 抗體、纖黏蛋白（Fibronectin）抗體（美國Abcam 公司）；GAPDH 抗體、β-actin 抗體（美國Sigma 公司）。ChemiDocTMMP 全自動凝膠成像和化學發光圖像分析系統、垂直電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3芪術抗癌方凍干粉浸提液制備芪術抗癌方由黃芪10 g、炒白術15 g、柴胡5 g、白芍10 g、薏苡仁30 g、淮山藥15 g、雞內金10 g、莪術10 g、白花蛇舌草15 g、炙甘草5 g 組成，各中藥材凍干粉由深圳市中醫院制劑科制備。浸提液制備方法：用微量天平稱取凍干粉置于無菌離心管中，以DMEM培養液充分溶解，用0.22 μm微孔濾器過濾得到母液，以DMEM稀釋獲得1 mg/mL濃度的浸提液，均現配現用。

1.4細胞培養與傳代人肝癌細胞株HepG2細胞復蘇后，以含體積分數10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養，培養條件為37 ℃、體積分數95%濕度、體積分數5%CO2。每2 d 換液1 次，當細胞生長融合達80% ～90%時，以2.5 g/L 胰蛋白酶[含0.2 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）]消化、傳代。

1. 5分組并鏡下觀察細胞形態將指數生長的HepG2 細胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后，空白對照組以DMEM培養液培養，TGF-β1組加入TGF-β 10 ng/mL 培養，中藥組分別加入TGF-β1 10 ng/mL+芪術抗癌方浸提液1 mg/mL、TGF-β1 10 ng/mL+芪術抗癌方浸提液2 mg/mL 培養。培養24 h后，顯微鏡下觀察各組細胞形態變化并拍照。

1.6劃痕實驗觀察細胞遷移能力實驗前在超凈臺用記號筆在6 孔板背后沿直尺均勻地劃橫線5 ～6 條，接種細胞量以隔夜能達到80%為計。第2 天吸除培養基，用槍頭比著直尺垂直于板背后的橫線劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗3 次，洗去劃下的細胞。分組培養方法同“1.5”項，分別于0 h 和培養24 h 在同一劃痕處顯微鏡下拍照。用ImageJ 軟件計算0、24 h 劃痕面積，愈合百分比=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1. 7蛋白免疫印記法檢測細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail的表達將指數生長的HepG2 細胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后分組培養方法同“1.5”項。48 h 后吸除培養液，將培養皿置于冰上提取細胞蛋白，蛋白濃度及配平采用Bradford 法，配平后于100 ℃水浴10 min 變性，離心，置于-80 ℃冰箱保存備用。根據蛋白分子量配制相應十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠，將等量蛋白進行電泳、轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉60 min，孵育對應一抗4 ℃冰箱過夜，孵育對應二抗，曝光顯影、圖像分析。采用Image-Lab軟件進行電泳條帶灰度值分析，結果以目的蛋白與內參蛋白（β-actin或GAPDH）灰度值的比值表示。

1.8統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量數據均以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD 檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組HepG2細胞形態變化比較圖1 結果顯示：HepG2細胞加入TGF-β1后，可見細胞形態呈細長多形樣間質表型轉變（箭頭處），而加入芪術抗癌方共培養的2個治療組，可見細胞呈鈍圓，維持緊密連接。

圖1 各組HepG2細胞形態變化比較（×40）Figure 1 Comparison of the morphological changes of HepG2 cells in various groups（×40）

2.2各組HepG2細胞遷移能力比較圖2 結果顯示：HepG2細胞加入TGF-β1后，細胞劃痕愈合百分比增加，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；加入芪術抗癌方共培養的2 個治療組細胞劃痕愈合百分比較TGF-β1 組均顯著減小（P<0.05）。

圖2 各組HepG2細胞遷移能力比較Figure 2 Comparison of the migration abilities of HepG2 cells in various groups

2. 3各組HepG2細胞上皮間質化蛋白表達情況比較圖3 結果顯示：TGF-β1 組上皮表型標記物E-cadherin表達水平較空白對照組降低，間質表型標記物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 和Snail表達水平較空白對照組均升高，其中，2 組的Fibronectin 表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。與TGF-β1組比較，芪術抗癌方2 個治療組E-cadherin表達水平均升高，N-cadherin、Vimentin、Snail 和Fibronectin 表達水平均降低，其中：芪術抗癌方1 mg/mL 組Vimentin、Snail 表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；芪術抗癌方2 mg/mL 組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統計學意義（P< 0.05 或P<0.01）。表明芪術抗癌方對HepG2 細胞上皮間質化的抑制作用呈濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越大。

圖3 各組HepG2細胞上皮間質化蛋白表達情況比較Figure 3 Comparison of the expression of EMT proteins in HepG2 cells from various groups

3 討論

芪術抗癌方為周小舟教授在臨床治療肝癌患者經驗中總結創立的。周小舟教授認為肝癌的主要病因是正氣不足與外感疫毒相互作用所致，結合現代醫學有關乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、過度飲酒等病原因素與機體免疫失調研究[7]的綜合結果，通過臨床調查發現肝癌的主要證型是氣虛血瘀[8]。芪術抗癌方以益氣散結、疏肝健脾為法，方中：黃芪益氣扶正、莪術活血消積為君，白術、雞內金、山藥補脾散結為臣，柴胡、白芍疏肝柔肝，白花蛇舌草、薏苡仁養肝利濕為佐，炙甘草調和諸藥。突出了“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的思想。周小舟課題組對芪術抗癌方進行了系列臨床研究，發現經導管肝動脈化療栓塞術（TACE）+抗癌方組與單純行TACE組比較，總有效率分別為90.6%（29/32）、65.6%（21/32），腫瘤初次復發率分別為9.37%（3/32）、34.38%（11/32），可明顯改善患者的生存質量、減少腫瘤的復發和轉移并提高患者的生存率[9]。

上皮間質化是胚胎發育和器官形成過程中至關重要的細胞重塑過程，是上皮細胞獲得間質特征的細胞生物學行為，表現為上皮細胞失去極性和細胞間連接，變成多形和松散的間質狀態。上皮間質化是執行對特殊誘導轉化因子即上皮間質化轉錄因子（EMT-TFs）、miRNAs、表觀遺傳和轉化后調節子表達的反應[10]，誘導上皮細胞去分化，抑制上皮細胞特征蛋白的表達，包括E-cadherin，以及激活間質化表型蛋白，包括N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等。SNAIL、TWIST、ZEB家族被認為是主要的EMT-TFs，已被大量實驗證實[11-12]。

癌細胞的上皮間質化以上皮細胞極性的喪失、E-cadherin 相關的細胞與細胞間黏合劑的崩解、間質標記陽性獲得為特征，誘導腫瘤細胞的遷移性增加[13]。在一定情況下多種經典生長因子均可誘發上皮間質化，這些因子不僅僅由腫瘤細胞分泌，也可以由腫瘤基質細胞分泌，其中TGF-β被認為是上皮間質化最有效的誘導因子之一[14-15]。中醫藥在肝癌的治療中顯示其獨特優勢，在對部分中藥單體（如姜黃素、槲皮素、木犀草素、白藜蘆醇等）及復方的研究中發現其有一定的抗上皮間質化效果[16]。

綜上所述，本研究用TGF-β1刺激HepG2細胞后，HepG2 細胞的形態向多形和狹長狀間質樣細胞轉變，間質表型蛋白表達增強，細胞遷移能力增加，提示TGF-β1誘導HepG2 細胞發生了上皮間質化。而加入芪術抗癌方共培養后，細胞可維持在緊密連接狀態，上皮表型蛋白表達增強，間質表型蛋白表達較減弱，細胞遷移能力下降，表明芪術抗癌方對TGF-β1誘導的HepG2細胞上皮間質化具有抑制作用，但這種抑制效果的具體機制還需要進一步研究。