離舌橐吾根部的抗腫瘤活性成分研究

徐 棟，劉 丹，張晨歡，張潤芳，王欽蓮，鄒 坤，2，王 慧，2*

(1.三峽大學生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)，湖北 宜昌 443002;2.三峽大學生物與制藥學院中國輕工業功能酵母重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

菊科植物離舌橐吾L.veitchiana(Hemsl.)Greenm.在民間應用廣泛，具有潤肺下氣、清熱解毒、抗菌消炎、化痰止咳和活血止痛等功效；主要用作治療流行性感冒、咳嗽、潰瘍和肺結核等癥[1].本課題組前期對其根莖醇提物的乙酸乙酯萃取部位進行了系統研究，從中分離鑒定了13個艾里莫酚烷型倍半萜[1].為了深入研究離舌橐吾根部抗腫瘤活性物質，本實驗探究了其醇提物石油醚萃取部位的化學成分，從中分離得到7個單體化合物，分別鑒定：bakkenolide A (1)，phthalic acid isodibutyl ester(2)，dibutylphthalate(3)，eremophila-7 (11)，9-dien-8-one(4)，6β，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(5)，6β-hydroxy-eremophil-7(11)-en-12，8β-olide(6)和6β-Hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(7).其中，化合物1為首個從離舌橐吾中發現的具有螺環骨架的倍半萜類化合物，6和7為一對非對映異構體.采用MTT法對所有化合物針對人胃癌細胞株(HGC-27)的體外抗腫瘤細胞抑制活性進行評價，結果表明化合物1對人胃癌細胞 HGC-27具有顯著的細胞毒抑制活性，其IC50為31.10 μg·mL-1.

1 儀器與材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；LC-6AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm × 10 mm，10 μm，半制備型，日本YMC公司)；Bruker AV 400核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；Thermo Scientific ISQ LT單四極桿質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；低溫冷凍干燥機(美國Labconco公司)；生物安全柜(Telstar Bio II Advance)；細胞培養箱(Thermo scientific)；倒置顯微鏡(Olympus CKX41)；離心機(Thermo scientific SORVALL ST16)；酶標儀(瑞士Tecan)；正相色譜硅膠和薄層色譜硅膠板GF254均為青島海洋化工有限公司產品；反相色譜硅膠為日本YMC公司產品；色譜純甲醇、乙腈為美國TEDIA公司產品，其他分析純試劑均為天津科密歐化學試劑有限公司產品.

離舌橐吾藥材于2017年7月采自湖北省神農架林區，經三峽大學生物與制藥學院王玉兵博士鑒定為離舌橐吾L.veitchiana，植物標本(LV2017001)存放于三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室.

人胃癌細胞(HGC-27)由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室提供.

2 提取與分離

離舌橐吾藥材根部9.60 kg，自然晾干，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次48 h，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏并用水分散后.萃取溶劑依次為石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯及正丁醇，最終經減壓濃縮獲得石油醚萃取部位.將石油醚部位(90.3 g)采用正相硅膠(200～300目)柱色譜分離，石油醚∶丙酮(100∶0→2∶1)進行梯度洗脫，得到151個流分.TLC分析后，合并Fr.35-37(733.3 mg)，經制備型HPLC分離(乙腈—水65∶35，3 mL·min-1)得到7個流分(Frr.1～7)，Frr.5(76.0 mg)經制備型HPLC分離(乙腈—水62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物1(8.7 mg)和化合物2(3.2 mg)；合并Fr.38～41(981.1 mg)，經制備型HPLC分離(乙腈—水62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物3(2.8 mg)和4(10.5 mg)；合并Fr.45～48(4 575.2 mg)，經反相硅膠柱(甲醇—水：30%→100%)分離，得Frr.1～44，對Frr.9(184.1 mg)，經高效液相色譜半制備分離純化(乙腈∶水=62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物5(7.9 mg)；對Frr.10(392.2 mg)，經高效液相色譜半制備分離純化(乙腈∶水=55∶45，3 mL·min-1)，得到化合物6(11.9 mg)和7(4.7 mg).

圖1 化合物1～7的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-7

3 結構鑒定

化合物1為無色固體，易溶于氯仿；EI-MSm/z：234 [M]+，分子式C15H22O2；1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=6.8 Hz，15-CH3)，0.92(3H，s，14-CH3)，4.70(2H，m，H-12)，4.96(1H，t，J=2.3 Hz，H2-13b)，5.04(1H，t，J=2.3 Hz，H2-13a)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.4(C-14)，19.2(C-15)，21.0(C-2)，23.4(C-1)，30.9(C-3)，33.9(C-4)，42.4(C-9)，44.0(C-5)，46.2(C-10)，48.6(C-6)，49.9(C-7)，70.4(C-12)，105.8(C-13)，150.4(C-11)，182.6(C-8).以上數據與文獻報道的bakkenolide A[3]數據基本一致，故鑒定化合物1為bakkenolide A.

化合物2為無色固體，易溶于氯仿；EI-MSm/z：278 [M]+，分子式C16H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:1.00(6H，d，J=7.2 Hz，H3-3′，H3-1″)，2.05(1H，m，J=7.2 Hz，H-2′)，4.10(2H，d，J=7.2 Hz，H-1′)，7.54(1H，m，J=6.0 Hz，H-4，5)，7.74(1H，m，J=6.0 Hz，H-2，6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：19.2(C-3′，1″)，27.8(C-2′)，71.8(C-1′)，128.9(C-4，5)，131.0(C-2，6)，132.4(C-1，2)，167.7(C=O).以上數據與文獻報道的phthalic acid isodibutyl ester[4]數據基本一致，故鑒定化合物2為phthalic acid isodibutyl ester.

化合物3為無色油狀物，易溶于氯仿;EI-MSm/z：278 [M]+，分子式C16H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7.72(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.54(2H，dd，J=5.7，3.3，H-4，5)，4.31(4H，t，J=6.7 Hz，H-1′)，1.73(4H，m，H2-2′)，1.45(4H，m，H-3′)，0.97(6H，t，J=7.4 Hz，H3-4′).13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：13.8(C-4)，19.2(C-3)，30.6(C-2)，65.6(C-1)，128.9(C-3，6)，131.0(C-4，5)，132.3(C-1，2)，167.8(COO-).以上數據與文獻報道的dibutyl phthalate[4]數據基本一致，故鑒定化合物3為dibutyl phthalate.

化合物4為無色油狀物，易溶于氯仿；EI-MSm/z:218 [M]+，分子式 C15H22O；1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，0.97(3H，s，14-CH3)，1.83(3H，s，13-CH3)，2.09(3H，d，J=2.0 Hz，12-CH3)，5.74 (1H，dd，J=1.7，0.7 Hz，H-9)；13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ：15.5(C-15)，16.1(C-14)，22.1(C-12)，22.6(C-13)，26.5(C-2)，30.6 (C-1)，32.6(C-3)，41.1(C-6)，41.9(C-5)，42.5(C-4)，126.2(C-9)，128.2(C-7)，142.3(C-11)，168.8(C-10)，192.4(C-8).以上數據與文獻報道的eremophila-7(11)，9-dien-8-one[5]數據基本一致，故鑒定化合物4為 eremophila-7(11)，9-dien-8-one.

化合物5為無色固體；EI-MSm/z:266 [M]+，分子式C15H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:0.79(3H，d，J=6.0 Hz，15-CH3)，1.14(3H，s，14-CH3)，1.89(3H，s，13-CH3)，4.62(1H，s，H-6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.6(C-13)，16.2(C-14)，16.3(C-15)，20.0 (C-2)，25.5 (C-1)，29.6(C-4)，30.6(C-3)，33.8(C-10)，39.1(C-9)，43.3(C-5)，70.9(C-6)，103.9(C-8)，125.0(C-11)，155.0(C-7)，171.4(C-12).以上數據與文獻報道的 6β，8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide[6]數據基本一致，故鑒定化合物5為6β，8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide.

化合物6為無色固體；EI-MSm/z:250 [M]+，分子式C15H22O3；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ：0.81(3H，s，14-CH3)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，2.03(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.80(1H，m，H-8)，5.07(1H，s，H-6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.2(C-15)，19.0(C-14)，20.2(C-2)，28.4(C-1)，28.4(C-3)，31.8(C-4)，35.4(C-10)，36.0(C-9)，44.8(C-5)，71.4(C-6)，77.5(C-8)，122.3(C-11)，162.5(C-7)，174.9(C-12).以上數據與文獻報道的 6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide[7]數據一致，故鑒定化合物6為6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide.

化合物7為無色固體；EI-MSm/z:250 [M]+，分子式C15H22O3；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:0.79(3H，d，J=6.4 Hz，15-CH3)，1.12(3H，s，14-CH3)，1.87(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.70(1H，s，H-6)，5.10(1H，ddd，J=10.6，6.9，1.8 Hz，H-8)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.3 (C-15)，16.4(C-14)，20.0(C-2)，25.8(C-1)，29.5(C-4)，30.6 (C-3)，33.8(C-10)，35.0(C-9)，42.9(C-5)，70.1(C-6)，78.3(C-8)，121.9(C-11)，161.2(C-7)，174.7(C-12).以上數據與文獻報道的6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide[8]數據基本一致，故鑒定化合物7為6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide.

4 體外細胞毒活性篩選

采用MTT 比色法測試所有化合物的體外抑制人胃癌細胞 HGC-27活性.收集處于對數生長期的人胃癌細胞HGC-27，制成單細胞懸液，培養液稀釋后，以每毫升(0.8～1)× 105個的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養箱中正常培養24 h后，將不同濃度(3.125，6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)的化合物加入孔中，每個濃度3個復孔，每孔終體積為 200 μL，另設空白對照孔若干，每孔加入100 μL的培養液.培養48 h后，于每孔加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)染色，繼續培養4 h，吸去原培養液，每孔加入DMSO 150 μL，低速震蕩5 min，使結晶物充分溶解，并用酶標儀在波長570 nm下測定吸光值，根據吸光度計算半數抑制濃度(IC50，μg·mL-1).結果顯示化合物1對HGC-27細胞的體外抑制作用較強，其IC50為31.10 μg·mL-1，其他化合物對HGC-27細胞的IC50均大于50 μg·mL-1.

5 結果與討論

離舌橐吾中含有萜類、甾醇類和皂苷類化合物，其中萜類化合物是離舌橐吾的主要化學成分，具有體外抗腫瘤活性[9].目前，國內外學者對離舌橐吾抗腫瘤活性物質基礎研究較少，僅從離舌橐吾中分離鑒定了1個具有體外抗腫瘤活性的萜類化合物eremophil-6-en-11-ol，其對人肺腺癌細胞(A549)和人胃腺癌細胞(BCG823)的IC50分別為10.27和31.34 μg·mL-1[10].

為了深入研究離舌橐吾抗腫瘤活性成分，本實驗采用多種柱色譜技術結合波譜技術，從離舌橐吾根部醇提物石油醚萃取部位中分離鑒定了7化合物，即：bakkenolide A (1)，phthalic acid isodibutyl ester (2)，dibutyl phthalate (3)，eremophila-7(11)，9-dien-8-one(4)，6β，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(5)，6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide(6)和6β-Hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(7).化合物1，2，4和7為首次從該植物分離得到，化合物6和7為一對非對映異構體.用MTT法測定了所有化合物的體外抗腫瘤活性，結果表明化合物1對人胃癌細胞(HGC-27)具有良好的抑制活性，其IC50為31.10 μg·mL-1，其他化合物對HGC-27細胞的IC50均大于50 μg·mL-1.

化合物1為首個從離舌橐吾中分離得到的具有螺環骨架的倍半萜內酯類化合物.倍半萜廣泛存在于植物、微生物、海洋生物及某些昆蟲體內，具有多種生物活性.倍半萜內酯抗腫瘤作用機制復雜多樣，主要包括[11]：1)逆轉腫瘤細胞的耐藥性；2)控制Ca2+通道的釋放；3)影響腫瘤細胞的分裂周期；4)抑制DNA拓撲異構酶；5)抗血管生成；6)抑制細胞遷移；7)誘導細胞凋亡作用；8)雙向調節和提高免疫能力.已有研究發現，α-亞甲基-γ丁內酯環是倍半萜內酯的抗腫瘤活性基團[11].因此，推測化合物1的體外抗腫瘤活性可能與其α-亞甲基-γ丁內酯環有關，其抗腫瘤作用機制有待進一步研究.本研究成果豐富了離舌橐吾化學成分多樣性，并為闡明離舌橐吾抗腫瘤活性物質基礎提供了實驗依據.