朱頂紅根腐病病原菌的鑒定

孟慶忠，李孝鑒，易先達，李國榮，張 濤，呂 博

（1.湖北省農業科學院經濟作物研究所，武漢 430064；2.元謀縣果然好農業科技有限公司，云南 楚雄 651300）

朱頂紅（Hippeastrum rutilum），又稱華胄蘭（華北經濟植物志要）、對對紅、百枝蓮等，是石蒜科朱頂紅屬多年生草本植物，原產于南美洲。朱頂紅劍葉挺拔，花色豐富，花朵直徑5～30 cm、花葶高度10～70 cm，花瓣形態多樣，適宜盆栽、鮮切花生產、罐裝裸球（無需土壤及澆水）、道路綠化、庭院裝飾等，適應種植環境廣、觀賞花葉俱佳，作為高檔觀賞花卉市場前景廣闊［1-4］。

目前，國內科研單位報道多以組培快繁技術為主，針對病蟲害的研究較少。朱頂紅的花葉病毒病和紅斑病在栽培中較多常見，但對于朱頂紅根腐病認識不足，很多購買進口種球的消費者在種植過程中經常發生種球根盤腐爛，近而整株枯死，多是由于土壤通透性差、水肥管理不當而引起的朱頂紅根腐病。進口朱頂紅種球僵球問題也困擾著消費者，一種原因可能是種球因過度低溫冷藏導致自身調節問題，有待試驗驗證；另一種原因可能是新根萌發后受到根腐病病菌侵染，導致根尖發紅腐爛，進而產生僵球現象。魯憲［5］研究指出，朱頂紅根腐病從根部侵染，引起根部腐爛，慢慢擴展至種球，引起種球腐爛。染病葉片呈現出不規則紅褐色，進而引起早期黃葉。本研究結合形態學和分子生物學的方法，對朱頂紅根腐病的病原菌進行鑒定，為防治朱頂紅根腐病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

供試材料為進口朱頂紅品種花瓶（Gervase），取新萌發的發病根組織（圖1）帶回實驗室進行病菌分離。病原菌分離采用常規組織分離法：發病根組織洗凈后切成2～3 mm 的小段，置于3% 次氯酸鈉溶液中浸泡45 s，然后轉入75%乙醇溶液中浸泡60 s，再用無菌水清洗3 次，在無菌濾紙上吸干水分，最后用無菌手術鑷將其轉入馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PDA）平板中，25 ℃培養5 d。

圖1 朱頂紅根腐病根部

1.2 病原菌的單孢純化

挑取新鮮菌絲于Czapek 液體培養基中，置于25 ℃下160 r∕min 振蕩培養7 d，經3 層無菌紗布過濾后，吸取少量孢子液于血球計數板中，在40 倍光學顯微鏡下測定孢子液濃度，并用無菌水將孢子液濃度稀釋至106個孢子∕mL。再用無菌槍頭吸取1 μL 孢子液于PDA 平板中，加入100 μL 無菌水涂布均勻，25 ℃培養2～3 d，挑取病原菌單菌落。

1.3 病原菌接種

菌株采用活體接種。試驗設置a（劃傷根部對照）、b（劃傷根部接種）、c（幼嫩根部無劃傷對照）、d（幼嫩根部無劃傷接種）4 種處理。盆栽朱頂紅品種為進口品種艾斯黛拉（Estella），盆栽土壤經過121 ℃、120 min 滅菌處理。小心挖出盆栽朱頂紅新鮮根部，減少根部損傷，無菌水沖洗掉根表面土壤，用無菌雙刃刀片劃傷根部，脫脂棉浸透孢子液，包裹根部，對照采用無菌水浸透脫脂棉包裹，盆栽朱頂紅置于25 ℃培養室，5 d 后取樣觀察。

1.4 病原的鑒定

1）形態學鑒定：將病原菌接種于新鮮PDA 平板上，置于25 ℃培養箱中暗培養7 d，觀察菌落生長情況。挑取邊緣菌絲于Czapek 液體培養基中，25 ℃條件下160 r∕min 振蕩培養7 d，在顯微鏡下觀察孢子形態特征。

2）分子鑒定：采用CTAB 法提取病原菌菌絲DNA。采用PCR 擴增核糖體RNA 內轉錄間隔區（ITS）基因，ITS 基因擴增使用的引物為ITS1 和ITS4，由北京擎科新業生物技術有限公司合成。20 μL PCR 擴增體系：7 μL ddH2O、10 μL PCR Mix 試劑、Primer-1 和Primer-2 各1 μL、DNA 模板1 μL。PCR 產物送至北京擎科新業生物技術有限公司測序，并將得到的基因序列與NCBI 基因庫中的序列進行對比，確定菌株分類地位。

2 結果與分析

2.1 病原菌特征

病原菌在PDA 平板上的菌落呈圓形，菌絲最初為白色絨毛狀，隨時間菌落逐漸變為淺黃色。菌落中分生孢子有2 種形態，小型分生孢子卵圓形或橢圓形，有1～2 個橫隔，大小為（19.5～20.5）μm×（5.4～6.8）μm；大型分生孢子較直或稍彎曲為鐮刀形，有較多橫隔，大小為（27～43）μm×（4.5～5.4）μm。

圖2 病原菌菌落正面（a）；病原菌菌落背面（b）；病原菌分生孢子形態（c）

2.2 病原菌接種觀察

劃傷根部對照傷口輕微發紅（圖3a），可能是由于機械損傷導致朱頂紅種球根組織酚類物質氧化物積累所致。劃傷根部接種病菌（圖3b）傷口處腐爛潰縮，呈紅色并沿導管方向擴展，根表面可見白色菌絲。幼嫩根部未劃傷接種（圖3d）可見根部表皮變紅，根尖侵染變紅，幼嫩根部未劃傷對照（圖3c）未見異常病變，根尖正常。從發病根部上可重新分離得到該病原菌，重新分離得到的病原菌的培養性狀，分生孢子形態及大小均與最初分離到的菌株相同，確定該菌株即為病原菌。

圖3 人工接種菌株致病性測定

2.3 病原菌測序結果

將所得序列在NCBI 基因庫中進行序列對比，該病原菌菌株與Fusarium solanistrain F13 菌株的相似性為100%，片段大小為537 bp，其登錄號為KP310868.1。

3 小結與討論

有關朱頂紅根腐病病原菌的鑒定研究僅限于形態學方面，鑒定結果可能導致一定程度的誤差。目前國際上利用形態學與分子生物學相結合鑒定病原菌已成為一種趨勢［6-10］。綜合病原形態特征、ITS 序列比對結果，初步確定引起朱頂紅根腐病的病原菌為半知菌類叢梗孢目（Moniliales）瘤座孢科（Tuber?culariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的腐皮鐮刀菌（Fu?sarium solani）。

朱頂紅根腐病是一種嚴重的真菌病害，侵染全株疏導組織感染，進而引發整株腐爛枯死。其病原菌存在于土壤中，主要侵染根部，剛萌動的新根根尖易感染，使根尖發紅腐爛，對朱頂紅的品種繁育和栽培管理危害較大。目前，國內銷售的商品球大部分都是荷蘭、南非等國進口，對于國內消費者來說，其價格昂貴，國內有關朱頂紅育種與商品種球生產很少，嚴重制約朱頂紅產業的發展，商品種球國產化是朱頂紅產業發展的最大瓶頸，配套栽培技術方面的研究也相對滯后。呂英民等［11］指出引起朱頂紅根腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌，這與本研究結果不一致，可能由于種植品種、區域土壤環境和鑒定方法不同，本研究未分離鑒定出尖孢鐮刀菌。本研究初步確定了腐皮鐮刀菌是引起朱頂紅根腐病的病原菌之一，為朱頂紅栽培管理上提供理論依據。