基因芯片技術應用于頸項透明層增厚病例中的價值研究

丁小瑞 劉愛菊 張 瑋 張俊繪

1.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特 010000；2.內蒙古自治區婦幼保健院婦產科，內蒙古呼和浩特 010000

截止至2012 年調查顯示，中國的新生嬰兒出生缺陷為5.6%[1]，每年有約3.6 萬例新生兒染色體異常[2-3]。現實生活中大多流產、死胎及出生缺陷的罪魁禍首就是染色體異常[4]。隨著超聲技術的發展，產前超聲檢查成為產前診斷必不可少的工具，我國把區別于結構畸形的非正常聲像異常稱為超聲軟指標異常[5]，頸項透明層（NT）就是其中一項。NT 測量是妊娠早期篩查胎兒染色體異常的金標準[6]，NT 增厚與胎兒染色體異常呈正相關[7]。因此，NT 增厚作為產前診斷有創性篩查的指導依據。核型分析作為曾經產前診斷的金標準，在檢測NT 增厚病例中，部分染色體核型正常但最終胎兒出現異常，研究發現，是基因組發生了細小的不均衡變異，最多見的是微缺失和微重復[8]，此類型是傳統染色體技術無法檢測的。熒光原位雜交技術（FISH）、熒光定量（PCR）、染色體微陣列分析（CMA）等新興技術的出現，使染色體研究領域有了更進一步的提升。CMA 是一項新的基因芯片技術[9-11]，覆蓋全基因組進行掃描，高分辨率能夠發現極小的基因拷貝數變異。因此，這種基因技術，被用來解決上述基因組拷貝數變異（CNVs）即染色體片段的重復或缺失的疑難問題。本研究通過對NT 增厚病例行染色體核型分析及CMA檢測，對比兩者對異常染色體的檢出率，旨在探討CMA 在胎兒NT 增厚中的臨床價值，以及CNVs 在不同條件下檢出的差異性，以便更好地進行產前診斷及咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017 年12 月—2019 年12 月因超聲提示“胎兒NT 增厚”于內蒙古自治區婦幼保健院產前診斷中心同時行核型分析及CMA 芯片檢測的185 例單胎妊娠孕婦。孕婦年齡18～40 歲，平均（30.28±4.42）歲。研究對象納入標準：①單胎；②參照英國胎兒醫學基金會（FMF）的測量標準，孕11～13+6周測量NT 值，NT≥3.0 mm；③孕婦知情并簽署知情同意書加入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查及診斷標準 使用EPIQ 7 超聲波儀，檢查者嚴格按照英國FMF 的NT 質控標準進行操作。檢查孕齡11～13+6周，每個對象重復測量3 次，取最大NT 值納入研究。目前，對于NT 截斷值存在爭議，國際上多采用NT 厚度超過第95百分位數為NT 增厚，但目前大部分研究者仍在使用NT≥3.0 mm 為NT 增厚；2.5 mm≤NT＜3.0 mm 為NT 臨界增厚[12]，此次實驗選取標準為NT≥3.0 mm。

1.2.2 標本采集 在腹部B 超引導下分別行絨毛穿刺（孕11～13+6周）或羊膜腔穿刺術（孕16～24 周）抽取絨毛少許或羊水30 mL 進行細胞培養行核型分析及CMA 芯片檢測。

1.2.3 實驗方法 CMA：采集絨毛或1 mL 羊水進行細胞沉淀，通過基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國），提取全血基因組DNA，通過美國Affymetrix 公司的Cytoscan 750K Array 芯片進行DNA 的分析。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 處理數據，計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體結果異常的比較

染色體核型分析結果：總計185 例NT 增厚病例，染色體核型異常的39 例，染色體異常的發生率為21.08%，其中34 例為21 三體；3 例為18 三體；1 例：46，XN，del（18）（P11）；1 例：46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122]。CMA 結果：共計185 例NT 增厚病例，染色體異常的59 例，染色體異常的發生率為31.89%，其中40 例為染色體數目異常（35 例為21 三體，3 例為18 三體，1 例為14UPD，1 例為47，XXX）；19 例為染色體結構異常。見表1。

2.2 核型分析異常與CMA 結果比較

核型分析共檢出39 例染色體異常，包括21 三體34 例，18 三體3 例，嵌合體2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 檢測46，XN，后續檢測其父親染色體出現重合片段，證明染色體正常。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 檢測結果為21 三體綜合征。1 例：46，XN，del （18）（P11），CMA 檢測結果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA可以檢出核型分析中的非整倍染色體異常及對核型結果中未知額外標記染色體（sSMC）的內容和來源得出更明確的信息，但CMA 無法識別平衡重排（易位/倒位/插入）。見表2。

2.3 核型分析正常CMA 檢測結果

對于核型分析正常病例CMA 檢測結果：微缺失/微重復檢出較染色體核型分析額外提高10.81%（20/185），致病性CNVs 的檢出率提高7.03%（13/185），CMA在微缺失/微重復方面要明顯優于核型分析。見表3。

2.4 統計學分析結果

單獨NT 異常與NT 異常聯合彩超其他結構異常的病例，致病性CNVs 的檢出率分別是29.38%（47/160）和48.0%（12/25），差異有統計學意義（χ2=7.564，P=0.006）。高齡孕婦與非高齡孕婦的病例中，致病性CNVs 的檢出率分別是45.16%（14/31）和41.56%（64/154），差異無統計學意義（χ2=1.849，P=0.174）。

3 討論

目前，有創性產前診斷主要針對高齡、超聲異常、血清學篩查高風險等進行診斷[13]，傳統采用細胞培養和染色體核型分析。相對于傳統方法，CMA 技術分辨率更高，可檢出微缺失/微重復，然而CMA 可否替代傳統染色體核型分析作為主要產前診斷的方法，質疑一直存在[14]。

表1 NT 增厚病例行染色體核型分析及CMA 結果

本次研究將傳統核型分析與CMA 技術聯合用于產前診斷，目的是探討CMA 技術臨床應用價值。結果顯示：185 例NT 增厚病例，染色體核型分析中染色體異常39 例，CMA 中染色體異常的59 例，“NT 增厚”成為胎兒染色體異常的非特異標志物，NT 厚度與染色體異常和結構異常的發生有直接關系[15-16]。CMA 較染色體核型分析多檢測出的微缺失/微重復病例為20 例，13 例為可能致病性或致病性（65%）。CMA 可以檢測到所有核型分析檢測的染色體異常，并且對微缺失/微重復的額外檢出率為10.81%，額外有效疾病診斷為7.03%，為減少出生缺陷提供了一種新型的檢測手段。2015 年一些學者對NT 增厚但核型正常的胎兒進行CNVs 分析，得出具有致病性CNVs 的微缺失/微重復檢出率達7.7%～8.3%[17-20]，本次實驗與此結果相符。在我國≥35 歲的孕婦歸為高齡孕婦，高齡是唐氏兒的重要因素之一。唐氏綜合征在我國的確診率僅有2.4/萬，而發達國家卻高達（8～15）/萬。本次實驗中高齡孕婦與非高齡孕婦比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），與2019 年Wu 等[21]研究年齡因素在NT 增厚病例中CMA異常檢出率無差異相一致。

本實驗核型分析共檢出嵌合體2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 檢測46，XN，后續檢測其父親染色體出現重合片段，證明染色體正常；雖說平衡重排一般不致病，但對未來妊娠會帶來后果[22]。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 結果為21 三體綜合征。結構異常1 例：46，XN，del（18）（P11），CMA結果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA 可以檢出核型分析中的非整倍染色體異常及對核型結果中未知額外標記染色體（sSMC）的內容和來源得出更明確的信息，但CMA 無法識別平衡重排（易位/倒位/插入）。7 例意義不明VOUS，35%的VOUS 檢出會給CMA 的咨詢解釋帶來挑戰，我們要不斷學習，提高認知水平，努力使自己的認知水平與日新月異的科技發展水平相適應。隨著更多大規模前瞻性隊列研究和CMA 在產前診斷中的應用，CNV 數據庫將不斷完善，更多染色體病基因型-表型關系將不斷被闡明，CMA 在產前診斷領域將展現更大的應用價值。

表2 39 例異常核型分析與CMA 檢測結果比較

綜上所述，CMA 技術可提高產前診斷的準確性，但CNV 臨床意義的不明確性使產前芯片的臨床咨詢更具挑戰性，隨著技術的不斷提高和數據的大量積累，CMA 技術將在產前診斷中發揮越來越重要的作用。

表3 20 例核型分析正常與CMA 檢測結果比較