固相萃取結合高效液相色譜法測定甘草中6種有效成分的含量

洪 博 陳 剛 趙超陽 徐天嬌 孫輯凱 李文靜

齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

甘草性平，味甘，歸十二經，是一種補益中草藥，能清熱解毒，潤肺止咳，有調和諸藥性的效果[1-7]。甘草中的主要活性成分有芍藥苷、甘草苷、甘草酸等[8-13]。本研究選取已明確藥理作用、能代表甘草臨床作用的相關成分（芍藥內酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸）作為研究和分析的對象[14-16]。有實驗顯示，芍藥內酯苷具有鎮靜、抗感染及護肝作用[17]；芍藥苷有降低血黏度、改善微循環、抗氧化等多種活性[18]；芹糖甘草苷具有止咳、平喘、化痰的作用[19]；甘草苷能抑制潰瘍的形成，并有抗氧化、抗人類免疫缺陷病毒等多種活性[20-24]；苯甲酰芍藥苷有抗氧化、抗肝纖維化及抗腫瘤作用[11]；甘草酸有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等活性[12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1000 型高效液相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司，含四元梯度泵、在線脫氣機）；Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）；AL204 型萬分之一電子天平（精密度為0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；BJ-150型高速多功能粉碎機（義馬市樂億佳商貿有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥內酯苷（160516，純度＞98%）、芍藥苷（160524，純度＞98%）、芹糖甘草苷（160916，純度＞98%）、甘草苷（161201，純度＞98%）、苯甲酰芍藥苷（160517，純度＞98%）、甘草酸（160602，純度＞98%）均購自北京萊耀生物科技有限公司。甲醇、乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak 公司），磷酸（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司），乙醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司），水（杭州娃哈哈集團）。甘草產地為甘肅（1： 180215；2：1 860402；3：180506）和內蒙古（4： 181014；5： 181109；6：181119），藥材均經齊齊哈爾醫學院藥學院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為豆科植物甘草的干燥根和根莖，符合《中國藥典》2015 年版一部及四部的相關項下規定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相：0.05%磷酸-水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～22% B；10～32 min，22%～40% B；32～35 min，40%～45%B）；流速：1 mL/min；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25℃。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的配制

于10 mL 量瓶中制備6 種待測對照品溶液，加入甲醇溶解、定容，濃度分別為：芍藥內酯苷0.92 mg/mL、芍藥苷0.47 mg/mL、芹糖甘草苷0.99 mg/mL、甘草苷1.6 mg/mL、苯甲酰芍藥苷2.3 mg/mL、甘草酸0.44 mg/mL。

2.3 線性關系

按照“2.1”項下色譜條件測定各對照品溶液的峰面積，見表1。以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣濃度（μg/mL）為橫坐標（X），繪制得到的6 個活性成分的標準曲線均成良好的線性關系，見表2。

2.4 供試品溶液的制備

甘草藥材1.00 g 加入2 g 填料，用10 mL 70%乙醇萃取，濾液用0.22 μm 濾膜過濾，各種填料比較后選擇以中性硅藻土為填料。

圖1 對照品及甘草樣品的高效液相色譜圖

2.5 精密度實驗

取標準曲線中中間濃度的標準溶液，測定并計算6 個待測藥效組分峰面積的RSD 值，連續進樣6 次，結果分別為1.23%、0.95%、1.85%、1.21%、0.87%、1.08%，提示儀器精密度良好。

2.6 穩定性實驗

取供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定并計算6 個待測藥效組分峰面積的RSD 值，結果分別為0.75%、1.12%、0.99%、1.54%、0.81%、1.17%，提示24 h 內供試品溶液穩定性良好。

2.7 重復性實驗

制備供試品溶液6 份，測定并計算6 個待測藥效組分峰面積的RSD 值，結果分別為1.45%、1.98%、1.56%、0.97%、1.57%、1.48%，提示本方法重復性好。

2.8 加樣回收率實驗

取6 份已知含量的樣品，精密加入6 個待測化合物的對照品溶液，按照供試品溶液的制備進行提取，進樣分析，6 個藥效組分的平均回收率依次為98.44%、101.25%、96.78%、103.74%、97.85%、95.87%，RSD 值分別為1.98%、3.02%、2.85%、1.99%、2.47%、2.06%。

表1 各對照品的濃度C（mg/mL）及對應的峰面積A

表2 各待測成分的曲線方程及線性關系

2.9 藥效組分含量測定

制備6 批來自不同產地甘草藥材供試品溶液，進樣3 次，測定峰面積，計算含量。見表3。

表3 甘草藥材中6 種藥效組分含量的高效液相色譜分析（mg/g）

3 討論

本研究觀察了熱回流提取等傳統方法，最終確定使用固相萃取法進行提取，比較了不同材料的提取率，確定中性硅藻土為吸附劑，以10 mL 70%乙醇為洗脫劑的提取效果最好。

本研究比較了以甲醇-水、乙腈-水及水相中加入醋酸、磷酸為流動相進行梯度洗脫。當以0.05%磷酸-水-乙腈系統為流動相時，6 種成分的峰形對稱性明顯變好，分離度有所增加，且有較高的靈敏度和合適分析的檢測時間。色譜條件還考察了不同的流速，結果顯示，流動相流速為1.0 mL/min 時，分離度達到要求且分離時間短。

本研究綜合考慮6 個待測成分的最大吸收波長，同時考慮到流動相會對分析造成溶劑峰的影響，結合溶劑的截止波長，最終確定檢測波長為240 nm，可以避免一些雜質峰的干擾，為科學全面評價甘草藥材質量提供了實驗依據。