環(huán)狀RNA HIPK3在上皮性卵巢癌組織中的表達及其與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系探究

黃文鳳，倫朝偉，韋勵

(東莞市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，東莞 523000)

卵巢癌(Ovarian Cancer，OC)是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其病癥隱匿一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多處于中晚期且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，晚期OC患者5年累積總生存率(OS)僅為30%左右。上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)是卵巢癌最常見的組織學(xué)類型，約占卵巢惡性腫瘤的90%，其中高級別漿液性O(shè)C占EOC病理亞型的60%～75%左右，臨床預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1-2]。目前，以腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類化療為主的一線治療方案是OC臨床治療的主要手段，但其患者術(shù)后5年OS仍較低[3]。因此進一步探究EOC發(fā)生發(fā)展機制、找尋潛在腫瘤標(biāo)志物或治療靶點對提高患者預(yù)后具有重要意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在基因組穩(wěn)定性、細胞功能及生命多樣性等方面發(fā)揮重要作用，現(xiàn)為腫瘤臨床研究的主要方向。環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)是具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一種新型非編碼RNA，其表達水平高、穩(wěn)定且分布廣泛[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs在多種腫瘤中異常表達，參與調(diào)控細胞的增殖、侵襲及遷移，通過信號通路正向或負向調(diào)控癌細胞的生物學(xué)行為[5-6]。circRNA HIPK3是新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，由同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3(HIPK3)第2個外顯子環(huán)化而成，高通量測序及Circbase數(shù)據(jù)庫顯示circRNA HIPK3在人腦、心臟、結(jié)腸及肺和胃等5個正常組織中表達水平較高，提示其可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)circRNA HIPK3在肺癌、肝癌、膀胱癌及卵巢癌等中均差異表達，調(diào)控癌細胞的各種生物學(xué)行為，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程，具有成為治療靶標(biāo)的潛質(zhì)[7-10]。因此，本研究擬于臨床病理層面探究circRNA HIPK3在EOC組織中的表達及其與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系，以期為EOC臨床治療及提高患者預(yù)后提供價值參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2011年5月至2014年12月于我院接受手術(shù)治療的80例EOC患者的臨床病理資料。收集患者癌組織標(biāo)本進行研究，并選取其對應(yīng)癌旁正常組織(距癌灶邊緣大于5 cm)標(biāo)本作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)前影像學(xué)及術(shù)中、術(shù)后病理確診為EOC；均為原發(fā)性腫瘤接受手術(shù)治療；術(shù)前未行相關(guān)放化療治療，未合并其他腫瘤或既往有相關(guān)手術(shù)史；病理分期符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)中EOC診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除繼發(fā)性EOC病例；合并重要臟器功能異常；凝血功能障礙無法耐受手術(shù)者；臨床病理資料不完整病例等。

二、主要試劑和儀器

Trizol試劑(Invitrogen，美國)；Prime ScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)；Vii ATM7 DX熒光定量PCR儀(南京諾唯贊)。

三、研究方法

1.樣品收集：所有EOC患者原發(fā)灶癌組織及其對應(yīng)癌旁正常組織樣品(組織樣品大小2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm)均為手術(shù)無菌條件下獲取，冰凍病理，后置于低溫液氮中保存，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片等操作制成組織標(biāo)本，均來自我院病理科。

2.總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：采用Trizol法提取組織樣本總RNA，經(jīng)測量其濃度及純度后，按照Prime ScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板配置10 μmol/L PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用Vii ATM7 DX熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參。相關(guān)引物序列由上海捷瑞生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列如下：circRNA HIPK3上游：5′-TAGACTATGCGTCGCGCAGT-3′，下游：5′-TCGACTAGACAGCTGATTGTC-3′；GAPDH上游：5′-GCGTGTCATCCATCAGATGTATCAC-3′，下游：5′-GTGCTGATCAGTCGTT GCACGATACG-3′。反應(yīng)條件：50℃ 2 min、95℃ 10 min預(yù)變性，然后95℃變性15 s、60℃復(fù)性60 s、95℃延伸15 s，共循環(huán)40次。實驗重復(fù)3次，采用2-△△CT法分析目的基因相對表達含量。

4.術(shù)后隨訪：術(shù)后通過電話及門診復(fù)查等方式對入組患者進行為期5年隨訪。隨訪間隔：第1～2年每3月1次，第3～5年每6個月1次；隨訪內(nèi)容包括：常規(guī)體格檢查、腫瘤標(biāo)志物檢查、胸片、超聲、復(fù)查盆腔和腹腔計算機X線斷層掃描(CT)及磁共振成像(MRI)或CT等。隨訪時間截止2019年12月底。本研究以術(shù)后5年OS為研究終點。OS為自接受手術(shù)治療后次日開始至患者因任何原因出現(xiàn)死亡的時間。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、EOC患者臨床基本特征

入組80例EOC患者年齡為25～78歲，平均年齡(52.5±9.8)歲，平均體重指數(shù)(BMI)(23.4±3.8)kg/m2。入組患者的臨床基本特征見表1。

授予學(xué)分：經(jīng)考核合格，授予《金陵胎兒醫(yī)學(xué)高層論壇-胎兒疾病相關(guān)母嬰保健技術(shù)研討班》(省級繼教項目編號:2017320502011)Ⅰ類學(xué)分 5 分。

二、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果

與癌旁正常組織相比，EOC癌組織中circRNA HIPK3表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

表1 EOC患者臨床基本特征

與癌旁組織比較，*P<0.05圖1 circRNA HIPK3的表達情況比較

三、EOC臨床病理特征比較

根據(jù)癌組織中circRNA HIPK3表達水平的平均數(shù)進行分組，分為高表達組(n=31)和低表達組(n=49)。組間腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性差異(P<0.05)，而組間年齡、BMI、家族史、月經(jīng)狀態(tài)、腹水量、組織學(xué)類型及CA125水平等均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 EOC臨床病理特征比較

四、circRNA HIPK3表達量與EOC患者預(yù)后的關(guān)系

截止隨訪結(jié)束，入組患者均獲得完整隨訪資料，隨訪時間9～60個月，中位隨訪時間為42個月，其中失訪11例(高表達組3例，低表達組8例)，死亡38例(高表達組8例，低表達組30例)。K-M生存曲線分析預(yù)后OS結(jié)果表明，高表達組術(shù)后1、3、5年累積OS分別為96.8%、90.3%、74.2%，低表達組術(shù)后1、3、5年累積OS分別為89.8%、69.4%、38.8%；對比發(fā)現(xiàn)circRNA HIPK3高表達組患者具有更好的術(shù)后5年總OS，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)(圖2)。

五、Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

Cox比例風(fēng)險回歸模型單因素分析發(fā)現(xiàn)，腹水量、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后化療及circRNA HIPK3表達量與EOC患者預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)；多因素分析發(fā)現(xiàn)，分化程度(G3)、FIGO分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后未輔助化療及circRNA HIPK3表達量低是EOC患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05)(表3)。

圖2 生存分析函數(shù)

表3 EOC患者預(yù)后不良Cox風(fēng)險回歸分析

討 論

卵巢癌(OC)作為常見的婦科惡性腫瘤，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其不同組織類型的組織結(jié)構(gòu)及生物學(xué)行為具有較大差異，嚴(yán)重影響女性生命健康。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，非編碼 RNA在表觀遺傳學(xué)等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，大量非編碼RNA 相互影響形成高度復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細胞增殖、分化等生物學(xué)行為，參與疾病進展[11]。因此，深入探究腫瘤發(fā)病機制，找尋有效的腫瘤標(biāo)志物及治療新靶點是臨床目前研究的主要方向及重點。

circRNA是一種具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型非編碼RNA，其通過外顯子或內(nèi)含子環(huán)化將5’端和3’端連接，與線性RNA相比更穩(wěn)定，具有組織特異性和表達特異性[4]。研究表明，circRNA通過作為內(nèi)源性競爭RNA影響miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；基因表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控；直接結(jié)合RNA蛋白及直接翻譯表達有效蛋白等機制發(fā)揮生物學(xué)功能[12]。并有研究發(fā)現(xiàn)circRNA大量存在于真核細胞中且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以通過直接或間接調(diào)節(jié)基因或信號通路來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在人的血液及唾液等中穩(wěn)定表達，顯示出具有作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后標(biāo)志物的潛質(zhì)[13-15]。近年來，腫瘤研究領(lǐng)域證實，circRNA在胃癌、乳腺癌、高級別卵巢漿液性癌、結(jié)直腸癌、口腔癌、膀胱癌及肺癌等多種惡性腫瘤中均異常表達，通過上調(diào)原癌基因或抑癌基因進而發(fā)揮抑癌或促癌基因的雙重作用，調(diào)節(jié)癌細胞的各種生物學(xué)行為[16-22]。進一步分析臨床病理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，部分circRNA表達與腫瘤臨床病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小等病理因素及預(yù)后相關(guān)[23-24]。circRNAs特殊的閉環(huán)結(jié)構(gòu)及良好的穩(wěn)定性和組織特異性以及敏感性，使得其有望成為新的臨床腫瘤標(biāo)志物及治療靶點[4，13]。因此對差異表達的circRNA進行分析可于基因水平闡明腫瘤的發(fā)病機理及調(diào)控通路，為腫瘤的臨床干預(yù)及治療提供新的思路。然而目前有關(guān)circRNA在OC中的功能僅有較少研究報道，circRNA 0061140在EOC中高表達，促進癌細胞的生長及轉(zhuǎn)移，可能通過吸附miR-370調(diào)控叉頭框蛋白M1(FOXM1)表達，調(diào)控OC的進展[25]。circRNA ITCH在OC中低表達，其過表達時可抑制OC細胞的增殖和侵襲，通過靶向miR-145/Ras p21蛋白活化因子1(RASA1)信號通路抑制OC的惡性進展[26]。

Zheng等[27]利用基因芯片對多例正常組織及癌組織進行檢測發(fā)現(xiàn)，circRNA HIPK3在眾多癌組織中表達異常，其表達豐度是正常組織表達量的幾十倍，認為其可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志基因，或有可能作為腫瘤臨床診斷的標(biāo)記物。circRNA HIPK3通過調(diào)控多個miRNA調(diào)節(jié)細胞生長[27]。circRNA HIPK3通過調(diào)控miR-558抑制膀胱癌細胞中肝素酶的表達，circRNA HIPK3與HIPK3在膀胱組織中的表達負相關(guān)[9]。circRNA HIPK3通過吸附miR-7促進結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[28]。circRNA HIPK3通過分泌miR-124和調(diào)節(jié)肝癌水通道蛋白3(AQP3)的表達來調(diào)控肝細胞的增殖和遷移[8]。肺癌中circRNA HIPK3通過抑制miR-124發(fā)揮致癌特性[29]。circRNA HIPK3通過調(diào)控miR-654/IGF2BP3信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤進展，可作為預(yù)后標(biāo)志物[24]。而最新研究通過高通量測序篩選也發(fā)現(xiàn)EOC中circRNA HIPK3是表達豐度最高的circRNA，進一步研究發(fā)現(xiàn)OC細胞系中circRNA HIPK3表達下調(diào)，沉默其表達后促進了癌細胞的增殖、侵襲及遷移、抑制細胞凋亡，其機制可能通過競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)機制調(diào)控OC惡性進展；circRNA HIPK3表達上調(diào)可預(yù)測EOC不良預(yù)后[10，30]。然circRNA HIPK3在OC組織中的臨床意義尚不明確，基于此，本研究經(jīng)采用qRT-PCR檢測EOC組織及癌旁正常組織中circRNA HIPK3的表達，發(fā)現(xiàn)EOC組織中circRNA HIPK3表達顯著降低，提示在EOC中circRNA HIPK3可能發(fā)揮抑癌基因的作用；通過χ2檢驗分析circRNA HIPK3表達量與EOC患者臨床病理的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)circRNA HIPK3表達量與腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，提示circRNA HIPK3可能參與EOC惡性發(fā)展進程；K-M生存曲線及Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)circRNA HIPK3高表達EOC患者具有良好的OS，circRNA HIPK3低表達是影響EOC患者不良預(yù)后的獨立危險因素之一，提示circRNA HIPK3可作為EOC新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點。

但本研究由于樣本量小和樣本集中等局限性僅探究了circRNA HIPK3與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，未深入探究circRNA HIPK3參與調(diào)控EOC發(fā)生發(fā)展的分子作用機制。其次，有研究指出circRNA部分功能是通過直接或間接地調(diào)節(jié)自身親本基因的表達進而發(fā)揮作用[31]，而EOC中circRNA HIPK3與親本基因HIPK3間具有怎樣的表達相關(guān)性本研究尚未進行研究證實，也是本研究的不足之處。再者，就目前而言有關(guān)circRNA在OC中的研究報道相對較少。因此后期還需繼續(xù)擴大研究樣本量進行深入探究為本研究結(jié)果進行補充說明，進一步明確circRNA HIPK3的作用機制，同時找尋更多有效的腫瘤分子標(biāo)志物為OC的臨床診治提供更多價值參考。

綜上，EOC組織中circRNA HIPK3顯著低表達，circRNA HIPK3表達量與FIGO分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理及預(yù)后因素顯著相關(guān)，是影響EOC患者不良預(yù)后的獨立危險因素之一，可望作為新的臨床腫瘤標(biāo)志物及治療靶點應(yīng)用于臨床。