清熱除濕凝膠對HPV 16 陽性的宮頸癌荷瘤小鼠線粒體凋亡蛋白的影響

劉 君 馬秀麗 薛曉鷗

1.北京中醫藥大學東直門醫院婦科，北京 100700；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院婦科，北京 100700

宮頸癌是目前全球范圍內威脅女性生命健康的第四大惡性腫瘤[1]。有研究顯示，我國每年新發宮頸癌患者近10 萬，約有3 萬例患者因該病死亡[2]，發病年齡也逐步趨于年輕化。已經證實，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導致宮頸發生癌變的首要因素[3]。所以防治HPV 感染成為預防宮頸癌的重中之重，課題組的前期研究證實清熱除濕凝膠有較好的HPV 轉陰率，對HPV16 陽性的SiHa 細胞移植瘤的增殖有較好的抑制作用。本研究進一步觀察藥物對實驗鼠腫瘤組織線粒體凋亡蛋白表達的影響，以求能探究藥物發揮抑瘤作用的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只4～5 周齡雌性BALB/c 裸小鼠，體重（15±1）g，SPF 級，購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司（SCXK 京2016-0006），飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心（溫度：23～25℃，濕度：49%～51%）。實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準，批準編號：BUCM-4-2019041002-2041。

1.2 細胞

HPV16 陽性人宮頸癌SiHa 細胞株，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

1.3 藥物、主要試劑與儀器

清熱除濕凝膠及凝膠中輔料卡波姆940 由百川飛虹技術有限公司生產提供。順鉑注射液（齊魯制藥有限公司，生產批號：8M0506B02），10 mg/支。上海翊圣生物科技的TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士羅氏生物公司，貨號：11684817910）；重組Anti-Bax，ab2503、Anti-Bcl-2，ab182858、Anti-Caspase-9，ab202068、Anti-Caspase-3，ab184787（美國Abcam 公司）；PVDF轉印膜（美國PALL，貨號：XLL092-2）；ECL 化學發光試劑（美國PIERCE，貨號：ECL-0012）；MEM(EBSS)培養基（中國醫學科學院基礎醫學研究所）；胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號：10099141）、0.25%EDTA 胰蛋白酶（美國Gibco 公司，貨號：25200056）。電泳儀DG-300C（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；酶標儀ZS-3（北京市新風機電技術公司）；迷你雙垂直電泳槽DYCZ-24DN、迷你轉印電泳槽DYCZ-40D（北京市六一儀器廠）；攝像裝置及成像軟件系統（麥克奧迪實業集團公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 SiHa 細胞株經過復蘇、培養、傳代、生長良好的細胞進行凍存。造模前取對數生長期的SiHa 細胞，常規消化，用MEM（EBSS）=培養基重懸清洗，離心2 遍，1000 r/min，5 min（離心半徑157 mm），計數，制成濃度為2×107/mL 的細胞懸液，放置于冰上轉運，備用。取雌性5 周齡裸小鼠，用1 mL 注射器抽取充分混勻的細胞懸液，注入裸小鼠右前腿外上方皮下，0.2 mL/只。細胞懸液注入后可見以注射部位為中心的圓形隆起，每天觀察記錄注射區域變化，以注射部位出現平均直徑≥0.5 cm 質硬腫物為造模成功。成功后計算腫瘤體積大小，將腫瘤體積進行編號，運用隨機數字表將荷瘤小鼠分為五組，每組10 只。即模型組、卡波姆940 組、中藥組、順鉑組及聯合用藥組（卡波姆為凝膠中的輔料，故設置該組）。

1.4.2 給藥 造模后，模型組常規飼養；中藥組于成瘤部位給予清熱除濕凝膠外涂（每天每50 mm3瘤體體積外涂凝膠0.3 mL）；順鉑組：將10 mg 順鉑溶于66.7 mL生理鹽水中制成順鉑注射液腹腔注射（每10 g 體重注射0.2 mL，每3 天注射1 次）；卡波姆940 組：卡波姆940 外涂（每天每50 mm3體積外涂0.15 mL）；聯合用藥組：同時給予中藥外涂和順鉑腹腔注射，方法劑量同前；各給藥組均給藥28 d。

1.4.3 取材及標本制備 實驗結束后，取材前12 h 動物禁食不禁水，1%戊巴比妥鈉0.1 mg/g，腹腔注射麻醉。剝取小鼠的腫瘤組織，稱重、拍照后，取1/2 組織分裝入凍存管，繼而放入液氮中保存，用于Western blot 蛋白檢測細胞凋亡檢測。另一部分放入甲醛中固定，用于后續其他實驗。

1.5 結果判定

凋亡檢測：腫瘤組織切片經脫蠟、酒精水化等處理后每片滴加100 μL 1×Equilibration Buffer（按1∶5 的比例用去離子TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒附帶）使其全部覆蓋待檢樣本區域，充分反應后甩干，滴加緩沖液，進入暗室，沖洗，滴加PI 溶液，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察剝離下的小鼠腫瘤組織切片（200×），染色為綠色的點為陽性細胞，隨機取5 個不重復的視野，對陽性細胞進行計數，取均值，進行統計分析。計算細胞凋亡指數（apoptotic index，AI），AI（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

Western blot 蛋白檢測：取50～100 mg 腫瘤組織，加入RIPA 裂解液，冰上勻漿，4℃離心12 000 r/min，10 min，離心半徑6.2 cm。取上清，分裝，置于-80℃保存備用。配制適量BCA（A 液∶B 液=50∶1）工作液測定蛋白濃度，蛋白電泳（80 V 恒壓電泳）及轉膜（恒壓80 V轉移3 h）后分別按試劑說明書加入一抗和二抗（1∶2000 稀釋），檢測Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 蛋白。用Quantity One 圖像分析軟件讀取目標條帶的光密度值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件對數據進行分析。符合正態分布計量資料采用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，采用LSD-t 或Dunnett’s 檢驗。計數資料采用例數或百分比表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物干預對腫瘤組織凋亡的影響

與模型組、卡波姆940 組比較，中藥組、順鉑組、聯合用藥組細胞凋亡率均有升高，以聯合用藥凋亡率最高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而卡波姆940 組與模型組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1～2。

圖1 藥物干預后各組腫瘤組織細胞凋亡情況

圖2 藥物干預后各組腫瘤組織細胞免疫熒光TUNEL 凋亡圖（200×）

2.2 藥物對腫瘤組織凋亡相關蛋白表達的影響

與模型組、卡波姆940 組比較，中藥組、順鉑組、聯合用藥組Bax、Caspase-3 表達均上調，Bcl-2 表達均下降，且聯合用藥組表達最明顯，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組、卡波姆940 組比較，順鉑組、聯合用藥組Caspase-9 表達上調，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3～4。

3 討論

宮頸癌嚴重威脅女性健康，是目前病因較清楚的女性惡性腫瘤，即與宮頸HPV 感染有關，尤其高危型HPV16 型和18 型致病風險最高[3]。諸多研究致力于尋找具有抑瘤作用或者抑制HPV 病毒的有效藥物從而防治宮頸癌。清熱除濕凝膠由紫草、金銀花、苦參、黃柏、莪術、白及等多味中藥組成，全方清熱除濕，斂瘡止帶，殺蟲止癢。方劑來源于北京中醫藥大學東直門醫院名老中醫的治療宮頸炎癥的散劑經驗方，經過本團隊對藥味進行加減優化、劑型改良制成凝膠制劑，課題組前期經過幾年的研究發現清熱除濕凝膠外用有較好的HPV 轉陰率，改善患者宮頸炎、宮頸HPV感染臨床癥狀、影響患者免疫功能；凝膠及其中部分單體成分體外動物實驗能夠抑制裸鼠SiHa 細胞移植瘤增殖、促進腫瘤細胞凋亡等多方面作用[4-10]。本研究對其體外促進腫瘤細胞凋亡及其機制進一步研究。

圖3 藥物干預對腫瘤組織凋亡相關蛋白表達的影響

圖4 藥物干預對腫瘤組織凋亡相關蛋白表達的影響

細胞凋亡是細胞自主性、程序性的死亡，正常凋亡能夠有效地清除基因異?；蛩ダ霞毎菣C體在細胞層面優勝劣汰新陳代謝的過程。越來越多的研究證實腫瘤的發生是細胞增殖與凋亡之間的動態平衡被打破的結果，使一些該正常凋亡的細胞逃離凋亡，甚至過度增殖而成為腫瘤細胞。細胞凋亡分為細胞表面受體的外部凋亡途徑和線粒體介導的內在凋亡途徑[11]。本研究發現凝膠外涂能夠提高裸小鼠HPV16 陽性宮頸癌細胞移植瘤組織的細胞凋亡率，中藥組與模型組及其凝膠中輔料卡波姆940 組比較差異有統計學意義（P ＜0.05）。而且清熱除濕凝膠外涂還能上調小鼠移植瘤腫瘤組織中線粒體凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9 水平，下調Bcl-2 水平。注射化療藥物順鉑也有此作用，且順鉑與中藥外涂聯合用藥作用最強?？紤]中藥凝膠發揮促進腫瘤細胞凋亡的機制可能與線粒體內在凋亡途徑有關。線粒體凋亡途徑是Bcl-2 蛋白家族、半胱氨酸蛋白酶（Caspase 家族）及線粒體膜結構變化等諸多環節共同構成的一個復雜的凋亡網絡[12]。在細胞凋亡信號的誘導下，線粒體外膜通透性發生改變或者被破壞，使本身在線粒體內的物質如細胞色素C（CytC）、凋亡誘導因子（AIF）、核酸內切酶G 等穿過線粒體膜進入細胞質中，導致線粒體功能的喪失，細胞凋亡程序啟動，隨后引起一些列級聯反應，其中CytC 對線粒體損傷最為嚴重，使線粒體迅速喪失功能，最終引起Caspase 的活化，使DNA 降解，細胞凋亡[13-15]。Bax/Bcl-2 家族以及Caspase 系列蛋白是線粒體凋亡途徑中的重要凋亡相關蛋白。Bax為促凋亡蛋白代表，Bcl-2 為抑凋亡蛋白代表。Bcl-2/Bax 比值改變被認為是細胞凋亡逃逸的主要機制[16-17]。Caspase 是觸發細胞凋亡的關鍵蛋白家族，也是線粒體凋亡途徑的重要參與者[18]，上游凋亡始動因子Caspase-9和下游凋亡效應因子Caspase-3 是其中相對重要的蛋白酶，在其他Caspase 凋亡輔助因子輔助下參與細胞凋亡過程。已有研究證實宮頸癌及癌前病變組織中的Bcl-2 表達水平明顯高于正常宮頸組織[19]，且能通過促進Caspase-3 表達而達到抑制宮頸癌細胞增殖作用[20-21]。本研究發現清熱除濕凝膠能上調腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax，下調抑凋亡蛋白Bcl-2，從而進一步影響Caspase 家族，上調了Caspase-9 和Caspase-3，使腫瘤細胞凋亡率升高，這可能是藥物發揮抑瘤作用和促進腫瘤細胞凋亡的部分機制。

凝膠中的藥物成分多數為具有清熱燥濕、清熱解毒、殺蟲止癢斂瘡作用的中藥。相關研究也發現清熱類中藥能夠影響腫瘤性疾病的細胞凋亡[22-25]，為本研究中藥的作用提供佐證和研究支持，對藥物進一步研究開發和藥味拓展也奠定一定基礎。另外，本研究發現與中藥組和順鉑組比較，中藥與順鉑聯合作用，其促進腫瘤細胞凋亡、上調促凋亡蛋白Bax 下調抑凋亡蛋白Bcl-2 的作用均最強，提示中藥與順鉑有協同增效作用，與相關研究的結論類似[26]。藥物的具體機制和與抗腫瘤西藥的聯合作用等尚有待于更深層次的進一步研究。