不同劑量藏紅花提取液對大鼠慢性高眼壓模型視神經及軸漿流的影響

于敬妮 楊新光 楊尚飛 龔 珂 汪曉瑜

西安市第四醫院眼科，陜西西安 710004

青光眼是一組以視神經萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，為全球第一位不可逆致盲眼病[1]。而青光眼性視神經損傷是其核心問題，也是最終病理結局，組織學改變為視網膜神經節細胞（retina ganglion cells，RGCs）凋亡、神經軸突、細胞損傷及軸漿流受阻等[2-3]。研究證明[4]青光眼性視神經損傷，篩板擠壓，伴有視覺通路上外側膝狀體及初級視皮質的跨突觸神經元變性，軸漿流受損，導致微循環改變、神經營養因子缺乏，視神經進一步損傷。有報道藏紅花可以改善微循環和清除氧自由基，對缺血再灌注損傷模型有神經保護作用[5]。本課題組曾觀察到藏紅花提取液對兔高眼壓造成的視網膜節細胞減少及視功能損傷具有保護作用，推測與其改善微循環、抗氧化等效應有關。為了進一步了解藏紅花對慢性高眼壓視神經損傷的作用，本研究經上丘熒光金逆行標記、視神經光鏡及透射電鏡等檢查，觀察了藏紅花提取液對大鼠慢性高眼壓模型視神經及其軸漿流的影響，為其臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

0.5 %鹽酸丙美卡因滴眼液及妥布霉素地塞米松眼膏（16D04BA 15 mL 及OFTL1A 3.5 mg，美國愛爾康公司）；藏紅花由第四軍醫大學口腔醫院藥劑科提供。TonopenⅡ眼壓計（美國MedtronicsALON 公司）；光學顯微鏡（CX23 日本奧林巴斯株式會社）；透射電子顯微鏡（H-9500 日本日立株式會社）；熒光金染色劑（美國羅氏公司）。

1.2 藏紅花提取液的配制

藏紅花150 g，蒸餾水煮沸30 min 過濾2 次，濃縮，3 倍量950 mL/L 乙醇沉淀24 h，過濾，減壓蒸餾，稀釋成100 mL 裝瓶，滅菌。用水稀釋成50 g/L[6]。

1.3 實驗動物

32 只SPF 級健康成年雄性SD 大鼠，9～10 周齡，體重250～300 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（陜）2016-0018，合格證號22-9601018，并通過西安交通大學醫學院動物倫理委員會審查。排除眼部疾病，在避光、安靜，22～24℃，濕度50%～60%的環境下飼養。

1.4 慢性高眼壓模型的建立及藥物干預

32 只大鼠，以隨機數字表法分為高眼壓組、對照組、低劑量組和高劑量組，每組8 只，16 只眼。參考Shareef 等[7]的方法：大鼠用4%水合氯醛麻醉，0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，角鞏膜緣8∶00～1∶00 位剪開球結膜，暴露4 條表淺鞏膜靜脈，大頭針灼燒顳側、顳上、顳下靜脈；對照組僅剪開球結膜。術后妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。TonopenⅡ眼壓計測眼壓，術后眼壓>22 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）為造模成功。于術前和術后l d、3 d、l 周、2 周、3 周、4 周測眼壓，連測3 次，取平均值。測后用妥布霉素地塞米松涂眼。術前30 min 及術后每日10∶00～11∶00，按低劑量組、高劑量組大鼠腹腔分別注射藏紅花提取液20 mg/kg（0.5 mL）和80 mg/kg（2 mL）；高眼壓組和對照組注射生理鹽水0.5 mL，1 次/d，連續28 d。

1.5 標本制備及觀測

造模成功并給藥第25 天，大鼠深度麻醉下，固定在腦立體定位儀上，0.5%碘伏消毒，沿正中線切開顱頂皮膚向下分離達顱骨，按照Paxinos 大鼠腦定位圖譜[8]定位雙側上丘。鉆開顱骨相應部位，取3%熒光金，每側上丘注射兩點（深4.0 mm），每點注射1.5 μL，留針5 min。3 d 后，麻醉致死，12 點處做球結膜縫線標記，取出眼球及視神經。

眼球固定于4%多聚甲醛磷酸2 h，角膜緣后0.5 mm剪開眼球，去除角膜和晶狀體，分離視網膜并定向平鋪，干燥，封片。熒光照片RGC 計數，在熒光顯微鏡下用V 波段熒光激發，距視盤中心2 mm 上下左右拍照，照片放大150 倍。以MoticMed 6.0 數碼醫學圖像分析系統分析（每張切片隨機取6 個視野，每個視野0.2 mm×0.2 mm，視神經兩側各取4 個視野），計數標記細胞。

視神經分為球后1～2 mm 處的A 段和2～3 mm處的B 段。A 段用25 mL/L 戊二醛的磷酸鹽固定1 h，10 mL/L 鋨酸固定，脫水，包埋，切1 μm 厚半薄切片，甲苯胺蘭染色，定位，再切成50 nm 的超薄切片。醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后在電鏡下觀察，計數視神經軸突，每個標本取10 個方位，每個方位3 個視野，求平均值分析。B 段在40 mL/L 多聚甲醛后固定20 min，200 mL/L 蔗糖浸泡至下沉，Tissu-Tek 包埋，冰凍切片，片厚18 μm，置于-20℃，HE 染色觀察視神經情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下視神經的形態

對照組：視神經細胞數量豐富，纖維排列整齊（圖1A）；高眼壓組：視神經色淡，細胞數量很少，纖維排列紊亂（圖1B）；低劑量組：細胞數量有所增加，纖維排列較整齊（圖1C）；高劑量組：細胞數量、纖維排列接近對照組（圖1D）。

2.2 視神經超微結構

圖1 視神經橫斷面HE 染色（20×）

對照組：視神經軸突排列整齊，髓鞘、軸膜完整，軸索里細胞器豐富（圖2A）。高眼壓組：髓鞘間隙增大，結締組織過度增生，軸索里線粒體變性，微絲、微管崩解，軸膜髓鞘分離，沃勒變性（圖中紅箭頭），節段性脫髓鞘（圖中黑箭頭），軸突萎縮（圖中藍箭頭）（圖2B）。低劑量組：軸突結構破壞及數量明顯改善，但軸膜厚度不一，仍有脫離（圖2C）。高劑量組：軸突排列較整齊，髓鞘稍薄，軸膜完整，軸索里微管等細胞器豐富（圖2D）。

圖2 電鏡下視神經軸突（6000×）

圖3 視網膜逆行熒光金染色（150×）

視神經軸突計數：與對照組比較，高眼壓組軸突數量減小，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），與高眼壓組比較，低劑量組和高劑量組軸突數量增多，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），與低劑量組比較，高劑量組軸突數量增多，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表1。

2.3 逆行熒光金標記節細胞

對照組：標記RGCs 各象限分布均勻，視盤旁密度高，周圍區密度降低，血管自視盤放射狀分布，血管走形區無RGCs，細胞形態多為圓形，部分見軸突，熒光在細胞質，細胞外未見熒光金滲漏（圖3A）。高眼壓組：RGCs 各區域密度低，分布不規律，細胞質熒光金不均勻，部分熒光金滲漏，未見軸突顯現（圖3B）。低劑量組：RGCs 數目增多，熒光增強，邊界清晰，個別細胞可見突起（圖3C）。高劑量組：RGCs 數目豐富，熒光顯著增強，無滲漏，血管呈放射狀，其走行區無標記細胞，部分突起清晰可見（圖3D）。

表1 四組視神經軸突計數比較（個，）

表1 四組視神經軸突計數比較（個，）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與高眼壓組比較，bP ＜0.01；與低劑量組比較，cP ＜0.01

逆行熒光金標記節細胞計數：與對照組比較，高眼壓組節細胞數量減小，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；與高眼壓組比較，低劑量組和高劑量組節細胞數量增多，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組節細胞數量增多，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 四組逆行熒光金標記節細胞數量比較（個/mm2，）

表2 四組逆行熒光金標記節細胞數量比較（個/mm2，）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與高眼壓組比較，bP ＜0.01；與低劑量組比較，cP ＜0.01

3 討論

隨著高眼壓的持續，視網膜缺血缺氧時間的延長及機械壓力的持續存在，節細胞缺血受損，其軸突構成的視神經也損傷、變性，導致視神經軸漿流受阻，聚集在篩板區，此時線粒體產生的腺苷三磷酸無法被軸突膜利用，致使軸突蛋白的生成和移動大幅度減少，視網膜代謝受到影響進而導致節細胞凋亡[9-11]；同時，持續高眼壓使篩板中的環繞視神經束向后扭曲、變形，篩板受損，直接壓迫靠近膠原纖維的軸突，使軸漿流受到阻滯，靶組織的營養供給中斷[12]，神經通路受阻，影響神經軸漿流運輸，共同導致視網膜神經節細胞凋亡[13-14]。解剖上視神經由RGCs 的軸突匯聚而成，軟腦膜組織緊貼圍繞在視神經周圍，發出結締組織與神經膠質構成微小間隔，將視神經隔成神經纖維束，形成髓鞘，其間富含細胞器。本研究中光學顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察可見，高眼壓組軸突數量及結構破壞明顯。低劑量組軸突數量、神經髓鞘崩解和軸突變性程度均有所改善，而高劑量組神經結構損傷顯著改善，更接近于對照組。

以往研究[3,15]表明高眼壓等因素損傷視神經，神經系統出現脫髓鞘改變后，裸露的軸膜更易打開電壓門控鈣通道，鈣離子內流增多致軸突損傷，同時，脫髓鞘導致軸突內蛋白骨架破壞，出現沃勒變性，另外，在缺血性改變外，單純沃勒變性也會誘導氧化應激，誘導并啟動凋亡信號通路，造成神經細胞的凋亡[16]。而現代藥理學已證實藏紅花有改善血液循環、抗氧化、調控鈣離子通道，影響信號通路、抗凋亡、保護神經等作用[17-18]，在眼部及視神經保護方面也屢有報道[19-21]。本研究顯示高眼壓組視神經破壞明顯，出現一系列結構及數量改變，而高劑量組，結構損傷性改變明顯好轉，幾乎接近于對照組，說明藏紅花提取液對視神經損傷有改善作用，而高劑量作用顯著。

視網膜節細胞是視網膜中唯一能與大腦中樞發生神經系統信息傳遞的細胞[22]，也是青光眼等病變的靶細胞，RGCs 的準確計數是目前國際上公認的評價視神經損傷程度的重要形態學指標[23-24]；熒光金是一種性質穩定、靈敏度高的熒光示蹤劑，廣泛應用于神經細胞的標記，其標記的RGCs 呈金黃色強熒光。熒光金標記細胞質，而細胞核不著色，能很好地顯示樹突分支，細胞外無熒光染料滲漏，與周圍組織分界清晰，除RGCs 層外，其余各層均無熒光標記，除能很好地標記RGCs，還能計數RGCs，反映軸漿流情況，也能耐受多種組織學染色處理，不易粹滅[25]。本研究利用大鼠慢性高眼壓模型，以熒光金做為標志物，利用軸漿流運輸逆行標記RGCs，觀察和評價藏紅花對慢性高眼壓損傷后RGCs 的存活情況，反映其對視神經軸漿流的影響。結果顯示：對照組熒光金可通過神經傳導通路，利用軸漿逆行傳導，很好地標記RGCs。高眼壓組，標記細胞數量稀疏，熒光金被大部分阻斷，軸漿逆行傳導被破壞。低劑量組軸漿逆行傳導改善，而高劑量組細胞數量增多，形態顯著改善，甚至接近對照組。由此不難看出，藏紅花對視神經軸漿流有顯著改善作用，從而營養視神經，保護視網膜神經節細胞，改善視神經組織及超微結構，進而保護視神經。當然藏紅花對視神經損傷的作用也不僅限于本研究，其更深層次的作用機制，還需要進一步深入研究證明。