Bcl-2 和LC3 對膀胱癌發生發展及預后的相關性分析

周萬里 張建平▲ 潘永昇 徐衛東

1.南通大學附屬海安醫院泌尿外科，江蘇南通 226600；2.江蘇省南通市第一人民醫院泌尿外科，江蘇南通 226300

膀胱癌發病率在世界范圍內居惡性腫瘤第九位，死亡率排名第十三位，為泌尿系統最常見的惡性腫瘤[1]，且其發病率呈上升趨勢[2]，其中最常見的為膀胱尿路上皮癌[3-4]。非肌層浸潤性尿路上皮癌患者多采用經尿道膀胱腫瘤電切術（TURBT），而晚期患者則需輔助全身放化療[5-6]。研究膀胱癌的發病機制是國內外學者研究的重要課題[6]。細胞的凋亡與惡性增殖參與腫瘤的發生、發展[7]，其中Bcl-2 發揮抗凋亡作用，參與細胞癌變[8]。細胞自噬與細胞的癌變密切相關[9]。LC3 是自噬相關基因，參與自噬的調控[10-11]。本課題通過核酸干擾技術下調膀胱尿路上皮癌中Bcl-2 的表達，并研究細胞中LC3 表達及其對膀胱腫瘤細胞生物學行為的影響，分析其與臨床病理的相關性，從而探討Bcl-2 與LC3 的表達與膀胱癌臨床病理和預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 試劑

真核細胞表達載體pGenesil-1 購自上海生工，大腸桿菌DH5α 和人膀胱癌細胞株T24 為本實驗室保存，高糖DMEM 培養基（貨號：12800082）購自Gibco公司；RNA 抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號：SK1322）；MTT 購自Sigma（貨號：M5655-1G）；DMSO 購自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號：DN3039A）；Lipofectamine2000 購自Invitrogen（貨號：11668-027）；LC3 和Bcl-2 兔抗人抗體購自Abcam（貨號：ab192890、ab32124）；SP 免疫組化試劑盒（貨號：SP0041）購自福州邁新公司。

1.2 體外實驗

1.2.1 在膀胱尿路上皮癌細胞 （T24） 中轉染siRNA在高糖DMEM 培養基中于37℃、5%二氧化碳條件下培養T24 細胞，以5×105個/孔的密度接種在6 孔板中，使用脂質體轉染法，Lipofectamine2000 與重組質粒的比例為5∶1。對照組為空質粒和NC 質粒。

1.2.2 RT-PCR 檢測Bcl-2 和LC3 mRNA 表達 收集細胞，Trizol 法提取RNA，分光光度計檢測純度，80 V恒壓下電泳進行完整性檢測。RNA 樣品經逆轉錄反應合成cDNA 第1 鏈，然后進行PCR 擴增，β-actin 作為內參。擴增條件：50 μL 反應體系，cDNA 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP mix 4 μL，二價鎂離子（50 mmol/L）1.5 μL，上游引物（20 μmol/L）1 μL，下游引物（20 μmol/L）1 μL，Taq 酶0.5 μL，加DEPC 水至50 μL。反應條件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，這部分重復30 個循環；72℃5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，圖像使用Quantity One 軟件（Bio-Rad）進行定量分析。

1.2.3 Western blot 檢測Bcl-2 和LC3 蛋白表達 收取細胞，PBS 洗滌2 次，加入裂解液，冰上孵育20 min，4℃條件，13 000 r/min 離心10 min，收集上清。使用BCA 試劑盒進行蛋白定量，取10μg 蛋白進行SDS-PAGE。使用濕轉電轉膜儀（BIO-RAD）100 V 恒壓60 min 條件下將蛋白質轉到NC 膜。使用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，TBST 洗滌。Bcl-2 單抗（或LC3 單抗）4℃孵育過夜，TBST 洗滌。使用HRP 二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌后加入ECL 試劑，使用GE 成像系統拍攝，使用Quantity One 軟件進行定量分析。

1.2.4 細胞生長活力檢測 將轉染不同質粒的T24 細胞接種到96 孔板中，設置PBS 空白對照組。加入MTT溶液后培養4 h，棄去培養基，加入DMSO，室溫振蕩10 min，測定570 nm 處的吸光度，每組實驗重復3 次。

1.2.5 細胞凋亡檢測 采用Annexin-V 與PI 雙染法流式細胞術檢測轉染后的T24 細胞細胞凋亡。胰蛋白酶消化細胞后，分別加入Annexin-V 和PI，進行流式細胞術定量檢測。

1.3 在人體組織中研究Bcl-2 與LC3 的表達

1.3.1 組織樣本 收集2017 年1 月—2020 年5 月在南通大學附屬海安醫院泌尿外科進行經尿道膀胱腫瘤電切手術及膀胱鏡活檢的部分標本65 例，其中正常膀胱組織10 例，膀胱尿路上皮癌55 例，所有研究對象術前均未接受任何輔助治療。55 例膀胱癌標本中，男48 例，女7 例；年齡28～88 歲，中位年齡67 歲；按國際抗癌聯盟（UICC）的2002 年TNM 分期標準：Ta期26 例，T1期9 例，T2期14 例，T3期2 例，T4期4 例；42 例不伴淋巴結轉移，13 例伴淋巴結轉移。入組患者均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.3.2 石蠟固定 切取4 mm×4 mm×4 mm 的標本，以10%甲醛進行固定，然后石蠟包埋，進行41 μm 厚度連續切片并將其裱于APES 打底玻片。

1.3.3 免疫組化染色 采用免疫組化（SP 法），將組織芯片進行常規脫蠟至水，以及微波抗原修復，然后滴加過氧化物酶阻斷液，37℃下孵育10 min，加入非免疫動物血清，37℃下孵育l0 min，加入一抗工作液，37℃孵育1 h，加入生物素標記的二抗，37℃下孵育10 min，然后DAB 顯色10 min，進行蘇木精復染，脫水透明后，進行中性樹膠封固。陰性對照中以PBS 代替一抗。

1.3.4 結果判斷 Bcl-2 和LC3 蛋白的染色信號主要位于細胞質中。由兩名病理醫師閱片，隨機選取每張切片的5 個視野（40×），各對100 個細胞進行鏡檢，然后進行陽性細胞百分率和細胞染色強度評估，陽性細胞百分率4 個等級。0 分：無陽性細胞；1 分：陽性細胞數＜20%；2 分：陽性細胞為20%～75%；3 分：陽性細胞數＞75%。染色度4 個等級：0 分為無染色，1 分為淡黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃至棕褐色。總積分為二者分值的乘積：0 分（-），l～3 分（-/+），4～6 分（+），7～9 分（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對所得數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外實驗

2.1.1 Bcl-2 和LC3 mRNA 的表達情況 轉染重組質粒pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 之后，Bcl-2 mRNA 表達量及LC3 mRNA 的表達發生了下調。見圖1。

2.1.2 Bcl-2 和LC3 蛋白表達的變化 轉染pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 重組質粒后，Bcl-2、LC3 蛋白表達下調。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組Bcl-2 和LC3 蛋白表達低于NC 組及空質粒組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 Bcl-2 和LC3 蛋白表達的變化

2.1.3 T24 轉染Bcl-2 siRNA 后細胞生物學行為的變化 pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組細胞活力[（66.8±5.8）%]低于空質粒組[（94.2±2.1）%]及NC 組[（92.4±1.9）%]，差異有統計學意義（F=15.62，P=0.016）。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組細胞凋亡率（56.68%）高于空質粒組（5.88%）和NC 組（5.03%），差異有統計學意義（P ＜0.05）。

2.2 人體組織中Bcl-2 與LC3 的表達意義

2.2.1 免疫組化檢測癌與癌旁組織中Bcl-2 與LC3的表達 Bcl-2 和LC3 蛋白的陽性表達（箭頭所指）主要定位在細胞膜和細胞質，偶有胞核染色，為淡黃色或棕褐色。見圖3。正常膀胱組織和膀胱癌中LC3 表達的陽性率分別為27.27%（3/11） 和69.09%（38/55），表達差異有統計學意義（χ2=6.81，P ＜0.05）。Bcl-2 蛋白在正常膀胱組織及膀胱尿路上皮癌中的表達的陽性率（18.18%、60.00%）比較，差異有統計學意義（χ2=6.43，P ＜0.05）。

圖3 Bcl-2 和LC3 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達（40×）

2.2.2 癌組織中Bcl-2 與LC3 的表達與臨床預后及病理參數的關系 不同分級、分期的膀胱尿路上皮癌樣本中LC3 蛋白的表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。有無淋巴結轉移的膀胱尿路上皮癌樣本中Bcl-2 蛋白的表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

3 討論

細胞自噬是一個經過嚴格控制的降解細胞內生物大分子和內源性底物的生理過程[12-14]。自噬有助于腫瘤細胞在惡劣條件下的生存，而自噬的過度又會引起自噬性死亡[15]，從而抑制腫瘤的發生和發展[16-17]，自噬與腫瘤的關系可能是雙重的[18]。研究顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL 與自噬蛋白前體結合[19]，LC3 是自噬的標志，在囊泡成核過程中有助于自噬囊泡的形成[20-22]。

表1 膀胱癌組織中LC3 與Bcl-2 的表達與臨床預后及病理參數的相關性（例）

Bcl-2 基因是細胞凋亡的重要抑制基因[23-25]。本研究結果也證實Bcl-2 蛋白在膀胱尿路上皮癌中抗凋亡作用。Bcl-2 能預測膀胱癌的淋巴結轉移情況。LC3 蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中表達升高，提示膀胱癌中自噬活性升高[26]，且LC3 的表達水平隨著膀胱尿路上皮癌分級和分期的提高而提高。因此Bcl-2 和LC3 的表達在調控膀胱癌起協調作用，這一作用機制可能為Bcl-2 作用于自噬蛋白前體結合調控LC3 的表達。因此兩者結合能判斷膀胱癌的預后。

本研究對Bcl-2 作用于LC3 的具體作用機制沒有深入了解，且BCL-2 和LC3 在組織樣本驗證的例數偏少，期待以后大樣本及長時間隨訪來綜合判斷膀胱癌患者生存及預后的情況。