多組學技術(shù)應(yīng)用于化學品風險評估的研究進展

魏若瑾，李濟彤，常靜，楊璐，潘一帆，王會利,*，朱莉飛

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100086

現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展?jié)M足了人們?nèi)找嬖鲩L的物質(zhì)需求，但也產(chǎn)生了越來越嚴重的健康和環(huán)境安全問題[1]。以各種方式進入到環(huán)境中的化學品種類和數(shù)量日益增加，而絕大多數(shù)的化學品毒性數(shù)據(jù)是缺乏的[2]。傳統(tǒng)的化學品風險評估依賴于動物實驗，難以對大量化學品的毒性進行高效檢驗與預測，并且對化學品作用機制的研究較為匱乏。為了對化學品毒性進行更加準確、可靠的評估，往往需要大量的毒性數(shù)據(jù)，不僅需要明確化學品影響生物系統(tǒng)的機制，還需要確定不同毒性通路共同的關(guān)鍵事件，以便更快速、更準確和更全面地評估化合物的潛在風險[3]。因此，亟需建立更科學有效的方法，用于評估那些毒理資料缺乏的化學品的環(huán)境風險與健康風險。

與此同時，生物學和毒理學領(lǐng)域也有了一些重大發(fā)展。生物信息學、檢測技術(shù)和計算分析能力的進步，以及在分子水平上對毒理學的理解，都有助于我們獲得更大數(shù)量、更多類型的可用信息和可靠數(shù)據(jù)，并可以應(yīng)用于風險評估。正如Bradbury等[4]所指出的，我們要擺脫對體內(nèi)測試的過度依賴，更多地使用計算、分子和體外工具。美國國家科學研究委員會(NRC)提出，需要收集歸納生物系統(tǒng)以及化學品干擾機制的基本信息，從而提高對化學品毒性效應(yīng)的預測能力[5]。

組學是毒理學研究中強有力的且有很大發(fā)展前景的工具。隨著各種高通量組學方法在毒理學研究中的應(yīng)用與發(fā)展，我們獲得了大量的組學數(shù)據(jù)，進一步加深了對化學品的毒性效應(yīng)及分子機制的理解。多組學聯(lián)合分析的優(yōu)勢主要在于，通過對各種組學數(shù)據(jù)的綜合分析，可以更全面、更系統(tǒng)和更深入地研究化學品在生物體內(nèi)的作用通路，能夠為預測目標化學品的毒性機制提供更為可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐[6]。

1 多組學研究的相關(guān)技術(shù)(Related techniques of multi-omics)

1990年，人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)啟動[7]，催生了組學的研究，包括基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、脂質(zhì)組學以及表觀遺傳組學等。組學分析技術(shù)已被證明是揭示復雜生物過程的強有力的新工具，并已成功地應(yīng)用于微生物學、真菌學[8]、植物[9]和醫(yī)學[10]等領(lǐng)域。

1.1 基因組學

基因組(genome)，又稱染色體組，指一個物種單倍體的染色體數(shù)目，是物種全部遺傳信息的總和。基因組學(genomics)這一概念最早是在1986年，由美國科學家Roderick提出，基因組學的目的是對一個生物體所有基因進行集體表征和量化，研究它們之間的相互關(guān)系及對生物體的影響，并理解核苷酸序列的意義[11-12]。我們只有2個選擇：要么零敲碎打地去發(fā)現(xiàn)一個個重要的基因，要么就有選擇地測定數(shù)個動物(包括人類)的全基因組序列[13]。理所當然的，科學家們做出了科學的選擇，啟動了人類基因組計劃，開始了對基因組學的研究。“基因組序列圖”將奠定21世紀生命科學研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。基因組學包括3個領(lǐng)域：(1)結(jié)構(gòu)基因組學，包括基因定位、基因組作圖及測定核苷酸序列[14]；(2)功能基因組學，是指對基因功能的識別和鑒定；(3)比較基因組學，是對不同物種的整個基因組進行比較，增強對各個基因組功能和表達機理的認識[14]。基因組學技術(shù)正被應(yīng)用于研究經(jīng)化學物暴露后生物基因表達的變化，這些信息有助于更好地理解mRNA(轉(zhuǎn)錄組學)、細胞和組織蛋白表達(蛋白質(zhì)組學)以及代謝譜(代謝組學)的信息[15]。目前，常用的基因組學技術(shù)有DNA測序[16-17]、下一代測序[18]和單核苷酸多態(tài)性微陣列[19]等。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學

轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)這一概念最早由Velcuescu等提出，轉(zhuǎn)錄組是特定發(fā)育階段或生理狀態(tài)下細胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA總和[20-21]，發(fā)現(xiàn)和解釋轉(zhuǎn)錄組的復雜性是理解基因組功能的一個關(guān)鍵途徑[22]。轉(zhuǎn)錄組學是功能基因組學研究的重要組成部分，是一門在整體水平上研究細胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科[23]，依賴于對暴露動物組織中mRNAs水平變化的全基因組測量[24]。轉(zhuǎn)錄組學分析的主要目標是識別、表征和分類特定階段特定細胞、組織中表達的所有轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本可以量化轉(zhuǎn)錄組在病理條件下的差異表達[22]。迄今為止，轉(zhuǎn)錄組學是最先進和最成熟的組學技術(shù)[25]。轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)主要有微陣列技術(shù)[26]、基因表達系列分析技術(shù)[27]、大規(guī)模平行測序技術(shù)[28]和RNA測序技術(shù)[29]等。

1.3 蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是1994年由Wilkins和Williams提出的，是指在特定時間、特定條件下，在特定類型的細胞或個體中表達的所有蛋白質(zhì)[30]。蛋白質(zhì)組學(proteomics)主要闡明蛋白質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)、表達和功能模式及各種蛋白質(zhì)之間的相互作用[31]。與人類基因組計劃相呼應(yīng)，2001年，在美國成立了國際人類蛋白質(zhì)組研究組織(Human Proteome Organization, HUPO)，提出了人類蛋白質(zhì)組計劃[32]。雖然，基因指導蛋白質(zhì)的合成，但基因表達的水平不能代表細胞內(nèi)活性蛋白的水平[33]。蛋白質(zhì)組極其復雜并且隨時間變化而改變，蛋白質(zhì)修飾過程如磷酸化、糖基化等，對細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)起至關(guān)重要的作用[34]。蛋白質(zhì)組學對蛋白質(zhì)翻譯和修飾水平的研究進行了補充，是全面了解基因組表達的重要手段[35]。蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)的發(fā)展促進了對蛋白質(zhì)的定性定量檢測，但它仍然不如轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學敏感[36]。蛋白質(zhì)組學可分為：(1)表達蛋白質(zhì)組學，即對組織、器官、細胞和亞細胞中蛋白質(zhì)表達譜的研究；(2)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學，是對蛋白質(zhì)及其復合物三維結(jié)構(gòu)的測定，從原子分辨率的水平對其作用機制進行解釋；(3)功能蛋白質(zhì)組學，研究蛋白質(zhì)在定位、折疊和修飾等功能上的不同和差異[37]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)有二維凝膠電泳技術(shù)[38]、質(zhì)譜技術(shù)[39]等。

1.4 代謝組學

基因組學和蛋白質(zhì)組學分別從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動，而實際上細胞內(nèi)很多生命活動是發(fā)生在代謝層面的，基因和蛋白表達的有效的和微小的變化會在代謝物上放大，從而使檢測更容易。與蛋白質(zhì)和基因相比，代謝物會立即對細胞進程造成直接影響，并與毒理學表型密切相關(guān)[40]。而且，代謝組學可以使用體液如血液和尿液作為基質(zhì)，這些體液可以采用較少或無創(chuàng)的方法取樣，更加符合動物倫理，更加適用于人體健康的研究[25]。代謝組學的發(fā)展是基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及表觀基因組學發(fā)展的必然結(jié)果。代謝組學是從基因到生命有機體的級聯(lián)過程的最后一步，它展現(xiàn)了生命有機體系統(tǒng)的當前狀態(tài)，展現(xiàn)了環(huán)境與其自身遺傳、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達共同作用的結(jié)果。代謝組學在現(xiàn)有的英文表述中，同時存在2個不同的詞匯和概念，即Metabolomics和Metabonomics，Metabolomics研究的是細胞中所有小分子的成分和波動規(guī)律，Metabonomics動態(tài)跟蹤完整生物體中的代謝物，研究其對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律[41]。代謝組學的研究方法分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學。非靶向代謝組學是對樣品中所有可測量的代謝物進行系統(tǒng)全面的分析，靶向代謝組學則只對特定的代謝物進行定性定量分析[42]。與非靶向代謝組學相比，靶向代謝組學只對已知可能具有生物學效應(yīng)的幾種或幾類代謝物進行偏向性研究，數(shù)據(jù)處理更加簡單，分析更具有針對性[43]。Chai等[44]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)進行靶向代謝組學分析，探討多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)PCB91和PCB149對斑馬魚胚胎和幼體的毒性作用。PCB91/149暴露后，胚胎和幼體內(nèi)的獨特代謝物大多為氨基酸，對22種氨基酸進行定量分析，對22種其他代謝物進行半定量分析，對暴露期間顯著改變的特征代謝物進行代謝途徑分析，在胚胎和幼體中觀察到的共同途徑是精氨酸和脯氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，表明這2種代謝途徑參與了細胞生長發(fā)育的遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控。應(yīng)用于代謝組學最廣泛的技術(shù)有色譜法、質(zhì)譜法[45-46]及核磁共振法[47]等。

1.5 生物信息學

組學技術(shù)，特別是基因組學和蛋白質(zhì)組學，產(chǎn)生了大量關(guān)于全基因組基因表達譜、蛋白表達以及蛋白質(zhì)與外源性物質(zhì)(特別是有毒物質(zhì))相互作用的數(shù)據(jù)，使研究跨越從分子到系統(tǒng)的多個復雜尺度[48]。對這些龐大數(shù)據(jù)進行處理和分析，進一步明確生物學機制，需要利用生物信息學這門關(guān)鍵學科。生物信息學結(jié)合了統(tǒng)計學、計算機科學和生物學等學科[7]，以計算機為工具，用數(shù)學和信息科學的方法對生命現(xiàn)象開展研究，已經(jīng)成為組學研究的前沿學科之一[14]。目前，越來越多公開的生物信息數(shù)據(jù)庫可通過因特網(wǎng)訪問，例如Genbank、PDB(Protein Data Bank)和EMBL(European Molecular Biology Laboratory)等[49]。生物信息學分析的過程包括：(1)數(shù)據(jù)處理和分子識別；(2)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析；(3)通路分析；(4)數(shù)據(jù)建模[50]。生物信息學方法隨著組學技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展，但是對于方法的應(yīng)用還沒有建立起一個統(tǒng)一的標準，這是生物信息學面臨的挑戰(zhàn)，因為不同的生物信息學方法應(yīng)用于相同的數(shù)據(jù)集可能產(chǎn)生截然不同的結(jié)論[51]。

2 多組學技術(shù)在化學品風險評估中的應(yīng)用(Application of multiple-omics techniques in chemical risk assessment)

多組學是多種高通量組學技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，主要包括基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等手段，對相關(guān)數(shù)據(jù)進行綜合分析，從而對作用機制進行更加深入的了解。早期的研究僅使用單一的組學技術(shù)進行毒理機制分析，然而，生命調(diào)控過程并不僅僅存在于單一層面，而是涉及到基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組等多個層面的共同作用。因此，聯(lián)合多組學技術(shù)，更加全面、系統(tǒng)地對化學品進行致毒機制研究和風險預測是勢在必行的。

2.1 風險預測

隨著全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度在各國的實施，對化學品鑒定及危險性預測技術(shù)的要求越來越高[52]。為快速識別并預測化學品的危險性，許多學者開始將多組學技術(shù)應(yīng)用于化學品風險預測。Simoes等[53]為了揭示一種草甘膦類除草劑對土壤跳蟲的毒性機制，應(yīng)用RNA測序和霰彈槍蛋白組學分別評估轉(zhuǎn)錄和蛋白表達差異。在Illumina HiSeq2000平臺上進行下一代測序，使用Bowtie軟件將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組進行比對，使用limma和edgeR軟件包，通過廣義線性模型進行回歸分析，并對偽發(fā)現(xiàn)率進行校正，得到差異表達的轉(zhuǎn)錄本。使用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)對預處理后的樣品進行分析，使用ProteinPilot軟件對多肽和相應(yīng)預測蛋白進行鑒定和相對定量。研究發(fā)現(xiàn)，此類除草劑暴露會影響正常的細胞呼吸和脂質(zhì)代謝，誘導氧化應(yīng)激，并導致蛻皮和生殖等生物生命周期活動發(fā)生損傷。Chatterjee等[54]應(yīng)用了基于DNA微陣列的轉(zhuǎn)錄組學和基于GC-MS的脂質(zhì)組學，對無定形納米二氧化硅粒子處理的人肝癌細胞(HepG2)進行生物信息學分析。研究使用MetaboAnalyst軟件進行代謝組學通路分析，使用IMPaLA軟件進行轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學的通路整合分析，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。綜合顯著改變的基因和代謝物的通路分析，發(fā)現(xiàn)對膽固醇生物合成通路的調(diào)節(jié)取決于無定形納米二氧化硅粒子的比表面積，比表面積越大，誘導膽固醇的水平越高。這一研究結(jié)果將為納米材料暴露提供一個監(jiān)管信號的范例。最重要的是，可以調(diào)整無定形納米二氧化硅粒子的表面積來控制誘導的膽固醇水平，并且為進一步的生物應(yīng)用設(shè)計安全的方法。Gavin[55]利用轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學技術(shù)，用非靶標方法進行大型溞的銀暴露研究，避免了傳統(tǒng)假設(shè)驅(qū)動研究方法的潛在局限性。使用IMPaLA軟件進行轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學數(shù)據(jù)集的聯(lián)合通路分析，用Fisher精確檢驗進行數(shù)據(jù)分析。研究發(fā)現(xiàn)，銀暴露導致嘌呤核苷的積累與氧化應(yīng)激無關(guān)，盡管鳥苷和肌苷顯著增加的確切原因需要進一步研究，這2種代謝物已被證明可以作為銀暴露的潛在標志物，從而用于風險預測、疾病診斷等。

2.2 致毒機制研究

化學品的毒性可能是急性毒性，也可能是慢性毒性，或是長期毒性、遺傳毒性和生殖發(fā)育毒性等等，只通過常規(guī)的急性毒性試驗難以準確評估其毒性效應(yīng)及致毒機制，因此，亟需更加科學合理的技術(shù)，如多組學技術(shù)來進行化學品的致毒機制研究。Gonzalez-Ruiz等[56]在對3D神經(jīng)細胞的三甲基錫暴露實驗中，構(gòu)建了一個完整的框架來分析通過多因素、多平臺和多組學研究所獲取的數(shù)據(jù)，從而揭示三甲基錫誘導的生物合成路徑、神經(jīng)元分化和信號轉(zhuǎn)導過程的改變。研究使用ANOVA multiblock OPLS(AMOPLS)方法將不同液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)平臺的代謝組學數(shù)據(jù)進行合并，分析不同實驗要素對三甲基錫暴露的影響，使用Proteome Discoverer軟件對多肽和蛋白質(zhì)進行定性定量分析，通過將蛋白質(zhì)組學和代謝組學得到的互補生化信息結(jié)合，可以更好地了解暴露于化學品后發(fā)生的復雜細胞變化。在此研究中，選擇的平臺依賴于生物圖譜數(shù)據(jù)庫，能夠同時將各種組學數(shù)據(jù)集與這些圖譜進行匹配。在一些圖譜中，顯著修飾蛋白的比例高于顯著修飾代謝物的比例，而在其他圖譜中則相反，說明2種組學方法的結(jié)合提高了可信度。Wilmes等[57]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學與藥代動力學方法，研究了培養(yǎng)的人腎上皮細胞(RPTEC/TERT1)暴露于環(huán)孢素A(CsA)(一種有腎毒性的藥物)中的毒性效應(yīng)。研究采用Illumina HT 12 v3芯片陣列(約47 000個轉(zhuǎn)錄本)進行轉(zhuǎn)錄組學分析；采用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術(shù)標記多肽，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)測定，進行蛋白質(zhì)組學分析；采用軌道離子阱(Orbitrap)進行代謝組學分析。研究發(fā)現(xiàn)，在高CsA濃度時，細胞內(nèi)會同時出現(xiàn)線粒體紊亂、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象。Grison等[58]研究了低劑量鈾對大鼠腎臟的慢性毒性。在此研究中，使用LC-MS分析樣本，將數(shù)據(jù)使用SIMCA-P軟件進行多元統(tǒng)計分析，使用Cytoscape的插件Metscape和MetaboAnalyst構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)，檢測發(fā)現(xiàn)受到最顯著影響的2個代謝通路是煙酸-煙酰胺和不飽和脂肪酸的生物合成。轉(zhuǎn)錄組學相關(guān)分析采用RNA微陣列技術(shù)，所得原始數(shù)據(jù)使用R軟件分析，當調(diào)整后的P值低于0.5則說明基因發(fā)生差異表達，分析顯示有49個基因發(fā)生差異表達，其中，Nt5c2、Sirt6、Nnt、Nmnat1和Enpp3等基因可能與代謝物發(fā)生直接或間接的功能聯(lián)系。此研究結(jié)果揭示了慢性低劑量鈾暴露后，激活與氧化應(yīng)激和炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)基因的細胞過程。

3 挑戰(zhàn)及展望(Challenges and prospects)

盡管多組學技術(shù)較傳統(tǒng)的動物實驗有巨大優(yōu)勢，但將多組學技術(shù)應(yīng)用于化學品風險評估中，仍然面臨一些挑戰(zhàn)。

把多組學技術(shù)應(yīng)用于風險評估的首要挑戰(zhàn)就是如何與有害結(jié)局建立聯(lián)系[59]。風險評估的目的在于評估特定暴露方案造成有害結(jié)局的可能性。在人類健康評估中，有害結(jié)局可以被定義為個體出現(xiàn)疾病或不適。在生態(tài)評估中，有害結(jié)局可以定義為對種群及生態(tài)系統(tǒng)造成的影響。從本質(zhì)上來講，組學終點反映的生物現(xiàn)象是較低層面的，例如分子層面、生物化學層面，而風險評估和有害結(jié)局通常關(guān)注器官、個體和種群層面。因此，要想將組學技術(shù)有效應(yīng)用于風險評估中，就要在組學響應(yīng)和有害結(jié)局之間建立科學可信的聯(lián)系。建立此種聯(lián)系的生物學依據(jù)基于對基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝等的理解。由于生物系統(tǒng)是復雜的，我們對生物系統(tǒng)的理解是有限的，在應(yīng)用組學技術(shù)的時候可能會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[59]，因此，運用多組學方法，多方面、多角度地對有害結(jié)局路徑中的關(guān)鍵事件進行分析比單一的組學方法更有說服力。

多組學技術(shù)應(yīng)用于風險評估的另一大挑戰(zhàn)就是研究手段的標準化。盡管經(jīng)過幾十年的研究，組學方法仍未能從科學研究轉(zhuǎn)向監(jiān)管應(yīng)用[60]。組學技術(shù)的監(jiān)管實用性意味著監(jiān)管研究必須具有可重復性和可解釋性，用于監(jiān)管目的的數(shù)據(jù)生成過程需要標準化。目前，眾多機構(gòu)與學者正致力于此。例如，歐盟的致癌基因組學項目為研究組學檢測的可重復性以及評估相關(guān)的生物信息學方法提供了一個良好的平臺[61]；美國食品和藥物管理局(FDA)組織了MAQC(Microarray Quality Control)項目，旨在建立基因芯片、新一代測序技術(shù)規(guī)范及數(shù)據(jù)分析標準[62-64]；DNA元素百科全書聯(lián)盟(ENCODE)是由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)資助的跨國項目，自2003年開始運作，一直是基因組學領(lǐng)域分析手段標準化的主要貢獻者[65]。

傳統(tǒng)的健康風險評估是依據(jù)流行病學、動物實驗和體外實驗等數(shù)據(jù)確定人體暴露后是否會對健康造成不良影響以及造成不良影響的性質(zhì)和特點，此種方法較多組學技術(shù)工作量大，數(shù)據(jù)不足。目前，越來越多的學者把多組學技術(shù)應(yīng)用于人群暴露健康風險評估中。Luyten等[66]探討了母體的空氣污染暴露可能對胎兒產(chǎn)生的不利影響，發(fā)現(xiàn)探索基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組的整個代謝途徑比其他方法更有代表性。Yao等[67]探討了全氟/多氟烷基化合物(perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances, PFASs)暴露對人類健康產(chǎn)生的不利影響，發(fā)現(xiàn)PFASs會向細胞發(fā)出化學信號，進而向組織甚至器官發(fā)出信號，最終導致疾病。檢測并理解這些信號可以通過高通量組學技術(shù)來解決，包括轉(zhuǎn)錄組學、表觀基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學。

毫無疑問，在未來，新化學品仍然會以一個相當快的速度投入生產(chǎn)并進入市場，對化學品進行風險評估的壓力將會越來越大，工作量將會越來越重，對理解毒性機制的要求將會越來越高。為了促進人類健康，維護環(huán)境安全，風險評估需要應(yīng)用更可靠的新技術(shù)、新手段。隨著毒理機制研究的不斷深入，生物信息數(shù)據(jù)的大量收集，以及數(shù)據(jù)處理軟件的持續(xù)改進，多組學在化學品風險評估中必將起到越來越重要的作用。

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