代表性鯉科魚類青魚的物種敏感性評價

王京，鄭磊，閆振廣，李娟英

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室，北京 100012 3. 國家環(huán)境分析測試中心，北京 100029

魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對維持水生態(tài)系統(tǒng)功能完整性具有重要作用。同時魚類也是水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)中所必需的一類生物，在美國、澳大利亞和歐盟等發(fā)達國家或地區(qū)的水質(zhì)基準(zhǔn)研究中，均要求使用魚類的毒性數(shù)據(jù)以加強對其的保護[1-4]。相對于大部分發(fā)達國家和地區(qū)，我國正處于水質(zhì)基準(zhǔn)的探索研究階段，本土物種的篩選和毒性測試是水生生物基準(zhǔn)推導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一。

中國的淡水魚類資源中，有一半以上屬鯉科，其中在中國漁業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位的四大家魚(青魚、草魚、鰱魚和鳙魚)、鯽魚和鯉魚都是鯉科魚類[5-6]。由于其分布廣泛、易獲得且在魚類資源經(jīng)濟中具有重要地位等特點，對鯉科魚類進行物種敏感性評價很有必要。

青魚屬鯉科，青魚屬，因其具有生長速度快、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高等特點，在中國的淡水漁業(yè)中得到廣泛養(yǎng)殖，成為中國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一[7]。截至2018年，青魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達到69.13萬t[5]，因此在淡水魚經(jīng)濟中具有重要意義。青魚在中國分布廣泛、適應(yīng)性和繁殖能力強且易于培養(yǎng)[8]，開發(fā)青魚作為中國水質(zhì)基準(zhǔn)受試生物不僅易于獲得，且其毒性數(shù)據(jù)更能反映本土水環(huán)境的特點。青魚一般生活于水體底層，作為典型的底棲魚類，在外表、體型和生活習(xí)性等方面均與其他魚類有差異，因此，開發(fā)青魚作為受試生物更有利于制定適合本土的水質(zhì)基準(zhǔn)以及對水環(huán)境風(fēng)險進行全面評估。

目前污染物對青魚的毒性方面有一些研究[9-10]，但尚無對青魚物種敏感性的研究，且青魚在水質(zhì)基準(zhǔn)中的應(yīng)用研究也尚未報道。近年來，農(nóng)藥、有毒有機化學(xué)品和金屬因其對水生生物的潛在危害而備受關(guān)注[11-17]。因此本研究選用毒死蜱、苯并[a]芘、熒蒽和三價砷這4種毒性較強危害較大的污染物作為代表性化學(xué)物質(zhì)來評價青魚的物種敏感性。

本研究開展了上述4種物質(zhì)對青魚的急性毒性試驗，并搜集和篩選了文獻毒性數(shù)據(jù)。通過分析和比較，對青魚的物種敏感性進行了評價，以期為研究水質(zhì)基準(zhǔn)受試物種的選擇提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 測試生物與化學(xué)品

青魚魚苗，體長3.2～3.8 cm，體質(zhì)量0.31～0.39 g，購自河南省平頂山天惠花鳥市場。馴養(yǎng)所使用的容器為經(jīng)過高錳酸鉀消毒過的化學(xué)惰性材料制成的魚缸和水槽。實驗所使用的化學(xué)品均為分析級，購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。實驗用水為除氯自來水，經(jīng)72 h充分曝氣后使用，測定的水質(zhì)參數(shù)如下：pH 7.5±0.3，溫度(25±1) ℃，溶解氧≤空氣飽和值的60%，總硬度(以CaCO3計)185 mg·L-1。

1.2 實驗前處理

購買后的魚苗用少量高錳酸鉀消毒，經(jīng)過3次換水使魚適應(yīng)水質(zhì)，最后將魚放入準(zhǔn)備好的容器中進行馴化。馴化過程中，光照時間設(shè)定為12 h∶12 h(光照∶黑暗)。急性毒性試驗在實驗室馴化7 d后開始，在此期間，每2 d更換一次水，每天清理容器中的排泄物。每天在固定時間投喂少量食物，試驗前24 h內(nèi)不投喂食物。

1.3 急性毒性試驗

開展了水環(huán)境代表性污染物毒死蜱、苯并[a]芘、熒蒽和三價砷對青魚的96 h急性毒性試驗，試驗方法參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)測試方法[18]，有機污染物實驗選用丙酮作為助溶劑(<0.1 mL·L-1)。所有試驗均采用半靜態(tài)試驗，每24 h更換一次試驗溶液，4種污染物試驗濃度設(shè)定值如表1所示。每種污染物試驗均設(shè)一個空白對照組，每組試驗3個平行，每個平行放10尾魚。試驗開始3 h后開始連續(xù)觀察并記錄異常行為，并于24、48、72和96 h記錄死魚情況，試驗中及時撈出死亡個體。試驗結(jié)束時對照組魚死亡率不得超過10%。

表1 4種污染物的試驗濃度設(shè)置Table 1 Exposure concentrations of the four pollutants

1.4 化學(xué)分析

檢測4種污染物試驗的最低濃度組和最高濃度組在試驗溶液更新前后濃度，依據(jù)OECD化學(xué)物質(zhì)測試方法指南的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[18]，4種污染物的濃度變化均<20%，滿足毒性試驗的要求。具體檢測方法如下。

對于苯并[a]芘和熒蒽，采用高效液相色譜-熒光檢測器(Agilent 1200，美國)進行樣品分析[19]。色譜柱為Eclipse PAH柱(250 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為20 ℃。進樣量為20 μL，流動相為乙腈和水(60∶40,V/V)的混合液，流速為2.0 mL·min-1。苯并[a]芘和熒蒽的檢出限分別為0.004 μg·L-1和0.002 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為95.0%～98.7%。

對于As2O3溶液，樣品分析采用原子熒光法(PF 6-3，北京PG儀器有限公司)[20-21]。儀器條件如下：負高壓280 V，燈電流40 mA，霧化器預(yù)熱溫度200 ℃，載氣流速400 mL·min-1，保護氣流速900 mL·min-1。三價砷的檢出限為0.3 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為94.4%～99.3%。

毒死蜱溶液采用高效液相色譜-紫外檢測器(Agilent 1100，美國)進行樣品分析[22]。色譜柱為HC-18柱(150 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為25 ℃。進樣量為20 μL，流動相為甲醇和水(80∶20,V/V)的混合液，流速為1.0 mL·min-1。毒死蜱的檢出限為30 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為90.0%～93.8%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用直線回歸法求得青魚96 h的半致死濃度(96 h-LC50)的95%置信區(qū)間[23]，以污染物的濃度為自變量(X)，以相應(yīng)濃度下死亡概率作為因變量(Y)，應(yīng)用分析軟件SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理，建立“濃度-死亡概率”線性方程，并得出回歸方程以及相關(guān)的系數(shù)LC50、R2和95%置信區(qū)間等參數(shù)。

急性毒性數(shù)據(jù)來源于美國環(huán)境保護局(US EPA)ECOTOX(http://epa.gov/ecotox/)毒性數(shù)據(jù)庫和公開發(fā)表的文獻。急性毒性試驗數(shù)據(jù)的篩選原則：溞或其他枝角類和搖蚊幼蟲的急性毒性試驗終點選擇48 h半數(shù)致死或抑制濃度(48 h-LC50或EC50)，魚類及其他動物的急性毒性試驗終點選擇96 h-LC50或EC50[1]，單細胞動物的急性毒性試驗數(shù)據(jù)不予采用，未設(shè)立對照組、對照死亡超過10%的毒性數(shù)據(jù)棄用，同物種的急性毒性數(shù)據(jù)如果差異過大，應(yīng)被判斷為有疑點的數(shù)據(jù)而謹(jǐn)慎使用。

對所有獲得的急性毒性數(shù)據(jù)進行整理和排序：首先求得各個物種的種平均急性值(SMAV)，SMAV等于同一物種的所有LC50或EC50求幾何平均值。然后根據(jù)污染物對全部物種的SMAV從小到大進行排序并編號，以SMAV的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以每個數(shù)據(jù)的編號除以數(shù)據(jù)總數(shù)加1(即累積頻率)為縱坐標(biāo)作圖，數(shù)據(jù)處理使用Origin 2018軟件進行。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 4種污染物對青魚的急性毒性

4種污染物對青魚急性毒性的試驗結(jié)果如表2所示。對4種毒物的毒性數(shù)據(jù)比較來看，苯并[a]芘對青魚的毒性最高，其次為毒死蜱。根據(jù)OECD制定的毒性標(biāo)準(zhǔn)分級LC50<1 mg·L-1(第一等級)、1～10 mg·L-1(第二等級)、10～100 mg·L-1(第三等級)[24]，結(jié)合表2中青魚的毒性數(shù)據(jù)：熒蒽<10 mg·L-1，苯并[a]芘、三價砷和毒死蜱<1 mg·L-1，可知4種污染物對青魚的急性毒性均屬中高毒級，說明青魚可能是較為靈敏的受試生物。

表2 4種污染物對青魚的96 h-LC50值Table 2 96 h-LC50 values of four pollutants to Mylopharyngodon piceus

2.2 青魚的敏感性排序

按上述方法搜集并篩選了苯并[a]芘、毒死蜱、三價砷和熒蒽的急性毒性數(shù)據(jù)，獲得可接受的數(shù)據(jù)如下：苯并芘包括3門8科的13個物種毒性數(shù)據(jù)，其中5種魚類毒性數(shù)據(jù)；毒死蜱包括7門55科的120個物種毒性數(shù)據(jù)，其中40種魚類毒性數(shù)據(jù)；三價砷包括4門18科的24個物種毒性數(shù)據(jù)，其中15種魚類毒性數(shù)據(jù)；熒蒽包括5門25科的31個物種毒性數(shù)據(jù)，其中8種魚類毒性數(shù)據(jù)。對毒性數(shù)據(jù)進行分類排序，如表3和圖1所示。

在物種敏感性分布曲線上，物種敏感性隨累積頻率的降低而增加。前人研究發(fā)現(xiàn)[25]，生物受污染物脅迫的比例超過15%會對水生生物及群落造成一定風(fēng)險，超過30%時會有明顯風(fēng)險，超過50%時則會有嚴(yán)重風(fēng)險[26]。按此，本研究設(shè)定物種敏感性和累積頻率的關(guān)系為：累積頻率<5%為非常敏感，5%～<15%為敏感，15%～<30%為較敏感，30%～<50%為較不敏感，≥50%為不敏感。

從圖1和表3中可知，在全部物種敏感性排序中，魚類對各類污染物的敏感程度跨度較大，一般而言其敏感性低于浮游甲殼類動物(如大型溞等)和軟體動物(如無褶螺等)，而高于兩棲類動物(如澤蛙等)和昆蟲類(搖蚊幼蟲等)，在利用物種敏感性分布法推導(dǎo)苯并芘、硝基苯和三價砷水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)時也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象[27-29]。在魚類敏感性排序中，各科魚類排序差別也較大，一般鯉科魚類和鮭科魚類排在較為敏感的位置，而麗魚科魚類則對污染物不太敏感，造成該差異的原因可能是因為不同科的魚類對污染物的生物利用度差別較大。

圖1 青魚對不同污染物的敏感性排序注：*鯉科魚類；**鮭科魚類；***麗魚科魚類。Fig. 1 Sensitivity order of Mylopharyngodon piceus to different pollutantsNotes: The scientific name with “*” represents Cyprinidae; the scientific name with “**” represents Salmonidae; the scientific name with “***” represents Cichlidae.

表3 青魚對不同污染物敏感性排序Table 3 Sensitivity of Mylopharyngodon piceus to different pollutants

青魚對各類污染物敏感性具有顯著差異。雖然在毒性測試中，三價砷對青魚屬于中等毒性，但是無論是和全部測試物種還是和魚類相比，青魚對三價砷的反應(yīng)都是非常靈敏的。而相對于毒死蜱和苯并[a]芘而言，盡管這2種污染物對青魚的急性毒性為劇毒，但青魚的物種敏感性排序僅處于末端區(qū)域。究其原因，對于毒死蜱，徐瑞祥和陳亞華[30]曾報道，有機磷農(nóng)藥對無脊椎動物的毒性高于脊椎動物，尤其對甲殼類動物毒性最大，對魚類毒性較小；而對于苯并[a]芘，可能是因為其對魚類毒性研究較少且多為慢性毒性，造成數(shù)據(jù)不足所致。青魚對熒蒽的敏感性表現(xiàn)一般，Wu等[31]報道，相對于重金屬而言有機物對淡水水生生物的毒性較小，產(chǎn)生的毒性效應(yīng)主要由其代謝產(chǎn)物引起，且不如對重金屬的毒性效應(yīng)敏感。對以上4種污染物分析可得青魚具有成為三價砷的生物監(jiān)測指示生物的潛力。

青魚和斑馬魚同屬鯉科魚類，斑馬魚是毒理學(xué)研究中重要的模式生物，也是國際標(biāo)準(zhǔn)測試物種[32]。斑馬魚的毒性數(shù)據(jù)多為對處于胚胎和幼稚期的魚體進行毒性測試得到的，而本研究選取的青魚也處于幼稚魚期，將青魚和斑馬魚的物種敏感性進行比較發(fā)現(xiàn)(圖1)，整體而言青魚對污染物的敏感性優(yōu)于斑馬魚，尤其對于污染物三價砷和苯并[a]芘。三價砷和苯并[a]芘對青魚的SMAV值分別為1.98 mg·L-1和0.012 mg·L-1，對斑馬魚的SMAV值分別為18.45 mg·L-1和0.41 mg·L-1，兩者都相差了接近一個數(shù)量級。本結(jié)論是基于青魚幼稚魚的毒性測試得出的，是否具有普遍性還需要進一步研究。另外，青魚對三價砷特別敏感，而對于其他的污染物敏感性則較弱，這也體現(xiàn)了青魚可能的特異性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

(1) 4種污染物對青魚的毒性均較高，青魚幼稚魚的物種敏感性整體上可能比模式生物斑馬魚要高，說明青魚可能是較為敏感的受試生物；

(2) 青魚對本研究中4種污染物的敏感性具有顯著差異，對三價砷非常敏感，物種累積頻率為8%，對于其他污染物的敏感性則表現(xiàn)一般，因此在無機砷水質(zhì)基準(zhǔn)研究中值得關(guān)注；

(3) 魚類對本研究中4種污染物的敏感性差異較大，相對來說，鯉科魚類和鮭科魚類較為敏感，而麗魚科魚類則不太敏感；青魚作為中國典型的鯉科底棲魚類，在水質(zhì)基準(zhǔn)和風(fēng)險評估受試生物選擇中值得關(guān)注。

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