磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯導致小鼠神經毒性結局的潛在靶點研究

朱亭，嚴驍，鄒忠杰，王美歡，唐斌，許榕發，鄭晶,*，麥碧嫻，于云江

1. 中國科學院廣州地球化學研究所，有機地球化學國家重點實驗室，廣州 510640 2. 生態環境部華南環境科學研究所，國家環境保護環境污染健康風險評價重點實驗室，廣州 510655 3. 中國科學院大學，北京 100049 4. 廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006

近年來隨著各國對溴系阻燃劑的逐步禁用和淘汰，有機磷系阻燃劑(organophosphate flame retardants, OPFRs)作為替代品其生產量和使用量快速增長[1]。磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate, TDCPP)是目前使用量最大的OPFRs之一，被廣泛用于家具、兒童塑料玩具和汽車的內飾中[1-2]。作為添加型助劑，TDCPP以非化學結合的方式添加到材料中[3]，使用過程中極易釋放到環境中，研究顯示，在世界各地的大氣、室內灰塵、飲用水和生物體樣本中，以及電腦和手機等電子設備表面均檢測出一定濃度的TDCPP[4-6]，生活環境中的高檢出率增加了人體暴露風險，TDCPP在人體尿液、血液和頭發等樣品中也被廣泛檢出[7-8]。多項研究證實，TDCPP可能具有神經毒性、生殖發育毒性、內分泌干擾毒性和致癌性等[2,9-10]。由于TDCPP與具有較強神經毒性的有機磷農藥(organophosphate pesticides, OPs)氯吡硫磷(chlorpyrifos, CPF)結構相似，其潛在的神經毒性尤其值得關注。有研究發現，TDCPP能改變PC12細胞的神經元分化，從而影響神經發育[11]；此外，TDCPP能下調成年斑馬魚的神經系統發育相關基因的表達以及破壞神經元功能，引起神經毒性[2]；也有研究表明，TDCPP引起大鼠腦組織氧化損傷和炎癥反應[12]。然而目前關于TDCPP對哺乳動物的神經毒性及其作用機制的相關研究依然很缺乏。

代謝組學是一種研究生物體液或組織中的小分子代謝物整體變化情況的組學分析方法[13]。利用代謝組學尋找生物效應標志物可以明確環境污染物對生物代謝途徑的影響，為揭示毒性機制提供新思路。血液運輸是生物體內物質循環的主要方式，因此血液代謝組學在機體損傷和疾病狀態的生物標志物篩選上也具有獨特優勢。目前，已有不少研究利用血液代謝組學探討神經功能改變或帕金森病(Parkinson’s disease, PD)[14]、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)[15]和重度抑郁癥(major depressive disorder, MDD)[16]等神經疾病的發生和發展機制。此外，也有研究通過血液代謝組學探討空氣污染與中樞神經系統疾病發生之間的關聯[17]。

本研究使用基于1H-NMR的代謝組學技術結合腦組織神經因子基因表達量分析了TDCPP對小鼠神經系統的潛在毒性作用，篩選早期毒性標志物，為TDCPP的污染防治和毒性風險評價提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑與儀器

TDCPP(純度>95%，J&K Scientific百靈威科技，中國)；SV Total RNA Isolation Kit試劑盒(Promega公司，美國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMKit試劑盒購自日本Takara公司；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所；氘水(D2O)、Na2HPO4、NaH2PO4購自美國Sigma公司。

NanoDrop One微量核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；Step One Plus實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)；高速冷凍離心機5424R(Eppendorf公司，德國)；SpectraMax i3x酶標儀(Molecular Devices公司，奧地利)。AVANCE Ⅲ 500 MHz全數字化超導核磁共振譜儀(Bruker公司，瑞士)。

1.2 實驗動物分組、染毒及樣品采集

4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠16只，體質量15～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院SPF級動物房中，保持12 h/12 h的日/夜光照循環，室內溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，實驗動物自由飲水和攝食。將小鼠隨機分為溶劑對照組(給予等體積的玉米油)和TDCPP染毒組(300 mg·kg-1·d-1)，每組8只。染毒方式為灌胃染毒，灌胃體積0.1 mL，每日灌胃1次，連續染毒35 d。每3 d準確稱取并記錄小鼠體質量。根據世界衛生組織(WHO)報道的雄性小鼠經口攝入TDCPP的LD50為2 670 mg·kg-1[18]，本研究所選用劑量約為1/10 LD50。

末次染毒24 h后，使用3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)腹腔注射麻醉動物，待小鼠翻正反射消失且無疼痛反應后，用眼眶靜脈取血法采集血液樣品，全血室溫靜置30 min后3 500 r·min-1離心30 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存。隨后將小鼠脫頸椎處死，取全腦在冰上分離大腦皮層，稱量質量后放入樣品凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 神經炎癥關鍵基因表達的檢測

將小鼠大腦皮層組織在液氮中研磨后提取總RNA，以反轉錄獲得的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。檢測的基因包括神經營養因子-3(Ntf3)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)和成纖維細胞生長因子-22，-23(fgf-22、fgf-23)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)，內參基因為β-actin。設計引物序列如表1所示，采用20 μL體系，每個樣本進行3次平行試驗。

表1 qPCR基因引物序列Table 1 Gene primer sequences for qPCR

1.4 5-HT含量和AChE活性檢測

小鼠大腦皮層中神經遞質5-HT含量采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法，AChE活性采用化學比色法，均使用南京建成試劑盒測定。

1.5 血清樣品處理

小鼠血清室溫解凍，混勻后取200 μL加至5 mm的NMR測試管中，再加入150 μL磷酸緩沖液(含0.2 mol·L-1Na2HPO4和0.2 mol·L-1NaH2PO4，pH 7.4)和150 μL D2O，振蕩混勻，待上機測試。

1.6 1H-NMR測定及數據處理

小鼠血清樣品的1H-NMR試驗在500 MHz超導核磁共振譜儀上進行，實驗溫度為24.85℃；采用Carr-Purcell-Meibom-Gill(CPMG)脈沖序列抑制血清中蛋白質及脂蛋白較寬的共振信號，總回波時間2nτ=100 ms，弛豫延遲時間4 s，采樣時間3.28 s。

采用線寬為0.3 Hz的指數窗函數進行傅里葉變換。運用軟件MestReNova 6.1(Mestrelab Research S.L，Santiago de Compostela，西班牙)對所獲譜圖進行手動相位和基線校正后，參照乳酸的甲基共振雙重峰(δ 1.33)進行定標。切除δ 4.68～5.22范圍內的譜圖，在δ 0.5～9.5區域按δ 0.01等間隔分段積分，對各分段積分值進行歸一化處理。

1.7 統計學分析及通路分析

使用SPSS 20.0軟件進行數據分析。組間差異使用單因素方差分析，P<0.05時認為在統計學上具有顯著差異。歸一化的代謝組學數據使用SIMCA-P 12.0(Umetrics AB，Umea，瑞典)進行基于多變量統計的模式識別分析，經Pareto標度化預處理后，進一步進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。根據變量重要性因子(VIP值)>1來篩選潛在特征代謝物，并進行t檢驗獲得差異代謝物，顯著性水平設為P<0.05。用MetaboAnalyst在線數據庫(http: //www.Metaboanalyst.ca)對差異代謝物進行功能分析和通路定位，尋找顯著影響的關鍵代謝通路。

2 結果(Results)

2.1 小鼠一般體征

小鼠在研究過程中體質量變化如圖1所示。試驗期間對照組和TDCPP染毒組小鼠體質量均呈增長趨勢，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。TDCPP染毒組小鼠在研究過程中未出現肉眼可見畸變或行為異常。染毒35 d后，對照組與TDCPP染毒組小鼠體質量分別為(25.55±0.61) g和(23.56±1.26) g。

圖1 對照組與磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)染毒組小鼠體質量Fig. 1 Body mass of mice from control group and tris (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP) exposed group

2.2 大腦皮層5-HT含量及AChE活性

5-HT和AChE作為大腦中調節活動的重要神經遞質和神經傳導的關鍵性酶，是神經系統功能變化的重要標志物，常用于污染物神經毒性評價[19-20]。如圖2所示，經TDCPP持續染毒35 d后，TDCPP染毒組與對照組小鼠大腦皮層5-HT含量和AChE活性沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 小鼠大腦皮層5-HT含量和AChE活性Fig. 2 Concentration of 5-HT and activity of AChE in mice cerebral cortex

2.3 大腦皮層神經毒性相關基因表達

促炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，神經營養因子Ntf3、GDNF、fgf-22和fgf-23，以及一氧化氮合酶iNOS在大腦皮層中mRNA相對表達量如圖3所示。研究結果顯示，小鼠經TDCPP持續染毒35 d后，TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和GDNF的mRNA表達量顯著上調(P<0.05)，其表達水平分別是對照組的1.6倍、4.1倍、2.9倍、1.3倍和2.0倍。而Ntf3的mRNA表達量顯著下調(P<0.05)，其表達水平僅為對照組的53%。成纖維細胞生長因子fgf-22和fgf-23的基因表達水平在對照組與TDCPP染毒組小鼠之間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 小鼠大腦皮層神經毒性相關基因的相對表達量注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 3 Relative expression of genes for nervous toxic effect in mice cerebral cortexNote: *P<0.05, ** P<0.01, compared with control group.

2.4 小鼠代謝表型的改變

采用OPLS-DA研究對照組與TDCPP染毒組小鼠的代謝物圖譜差異，結果如圖4(a)所示。TDCPP染毒組小鼠血清中的代謝物與對照組在PC1維度上完全區分開，表明TDCPP染毒后小鼠機體的生理狀態和物質代謝發生了明顯變化。同時，采用置換檢驗(permutation test)驗證OPLS-DA模型的過擬合程度和可靠性(圖4(b))。OPLS-DA的主要參數為：R2X=0.83，R2Y=0.97，Q2=0.88。模型置換得到的R2、Q2點均低于原始點，且Q2回歸線與縱坐標軸的截距均小于零，說明建立的模型符合樣本數據的真實情況，且如有新樣本加入對原有分布情況影響不大，可以充分解釋兩組樣本間的差異。

圖4 小鼠血清1H-NMR譜的OPLS-DA得分圖(a)和置換檢驗驗證圖(b)Fig. 4 OPLS-DA score plot (a) and permutation test (b) derived from 1H-NMR spectra of mice serum

2.5 TDCPP誘導的差異代謝物與代謝通路分析

采用OPLS-DA模型，篩選同時滿足VIP值>1和和獨立樣本t檢驗P<0.05的代謝物作為TDCPP誘導的差異代謝物(表2)。結果顯示，小鼠在TDCPP持續染毒35 d后，血清中多種代謝物水平發生顯著變化，包括氨基酸、生物堿、羧酸、糖類、生長因子和脂質。進一步應用MetaboAnalyst對差異代謝物進行代謝通路分析(Pathway Analysis)，結果如表3所示。在TDCPP顯著影響的小鼠關鍵代謝通路中，3條通路與氨基酸代謝相關，2條通路與糖代謝相關。根據差異代謝通路繪制TDCPP誘導小鼠體內代謝紊亂的通路圖如圖5所示。

圖5 TDCPP誘導小鼠代謝紊亂的代謝通路圖注：紅色和綠色標記分別表示TDCPP染毒后小鼠血清中上調和下調的代謝物。Fig. 5 TDCPP induced metabolic pathway disturbance in miceNote: Metabolite names marked with red and green represent up-regulated and down-regulated in mice serum after TDCPP exposure, respectively.

表2 對照組與TDCPP染毒組小鼠血清中的差異代謝物Table 2 Potential biomarkers in mice serum between control group and TDCPP exposed group

表3 與TDCPP暴露相關的關鍵代謝通路Table 3 Key metabolism pathways related to TDCPP exposure

3 討論(Discussion)

廣泛使用的有機磷系阻燃劑TDCPP在多種環境介質和生物體中被檢出且具有較高濃度，其潛在的慢性神經毒性引起研究者們的高度關注。研究顯示，TDCPP能夠引起禽類步態模式和翼瓣反射等行為學異常[21]，改變斑馬魚孵化率、存活率和游動速率并誘導自噬[22]，并且影響大鼠的學習記憶能力和空間探索能力[12]。代謝組學是研究機體代謝產物變化的一種系統生物學方法，可通過揭示代謝產物變化規律來解釋機體物質代謝途徑改變。本研究利用代謝組學技術研究TDCPP對機體代謝網絡的影響，并結合神經毒性指標相互驗證和補充，為探索TDCPP的潛在神經毒性作用機制提供依據。

AChE是重要的中樞神經酶，作為生物標志物常用來評估環境物質的神經毒性。AChE活性受到抑制也是OPs的常見神經毒性作用機制之一。5-HT作為中樞神經遞質和外周調質，參與多項重要的生理和病理過程。本研究中小鼠經300 mg·kg-1·d-1的TDCPP持續染毒35 d后，未觀察到腦組織中AChE活性和5-HT含量的顯著改變(P>0.05)。以往研究也獲得了類似的結果，鰷魚[23]和斑馬魚[2]經急性或慢性TDCPP暴露后，大腦中AChE活性和神經遞質水平均沒有顯著變化。提示與CPF等OPs不同，TDCPP可能并不是典型的乙酰膽堿酯酶抑制毒物，或許其對生物體的神經毒性存在其他作用機制[2,23]。

神經炎癥反應是中樞神經系統產生的抵御感染和損傷的復雜級聯反應，長期的慢性炎癥反應可誘發或加重重度抑郁障礙(MDD)、阿爾茲海默癥(AD)、帕金森病(PD)等神經退行性疾病的病變[17,24-25]。TNF-α、IL-6和IL-1β是3類重要的促炎性細胞因子，iNOS則是一類可被促炎性細胞因子誘導產生的一氧化氮(NO)合酶，TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS均在慢性神經炎癥發展過程中積聚，對神經元造成損傷，其在腦組織中的表達量可反映機體炎癥水平和組織的損傷程度[26-27]。本研究發現，TDCPP染毒組小鼠大腦皮層中TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS基因表達水平顯著升高(P<0.05)，提示TDCPP暴露可能誘導小鼠腦組織發生炎癥反應，而iNOS基因的過度表達可導致NO增加，進一步加重腦組織損傷。NTF、FGF和GDNF是3類重要的神經營養因子，在神經系統發育、減輕神經退行性病變和神經損傷的修復過程中發揮著重要作用[28]。本研究結果表明，與對照組相比，TDCPP染毒組小鼠大腦皮層中GDNF基因表達量顯著升高，Ntf3基因表達量顯著降低(P<0.05)，fgf-22和fgf-23基因表達量無顯著改變(P>0.05)，提示TDCPP對神經營養因子轉錄水平的影響可能具有選擇性。相似的神經營養因子基因表達水平的改變也在TDCPP慢性暴露的鰷魚腦組織中被報道[23]。研究結果顯示，神經炎癥與神經損傷可能在TDCPP誘導的小鼠神經毒性中發揮作用。

血清代謝組學研究顯示，TDCPP暴露顯著干擾了小鼠的代謝過程，主要表現為氨基酸代謝、脂質代謝和糖類代謝的改變。多項代謝組學研究均證實，谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸等氨基酸和葡萄糖是包括MDD、PD在內的等多種神經性疾病的生物標志物，在患者血清中含量發生顯著改變[29]。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，對中樞神經系統內星形膠質細胞的產生具有重要作用，且與5-HT等神經遞質的含量關系密切，其缺乏可能引發抑郁[30]。谷氨酸作為興奮性中樞神經系統神經遞質，過量可引發“興奮性毒性”，導致受體過度激活和iNOS酶活性增加，破壞神經元完整性[31]。甘氨酸是中樞神經系統中谷氨酸及其N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的抑制性神經遞質和調節劑，過度積累也和抑郁癥的病理生理有關[29]。肌酸是磷酸肌酸前體，磷酸肌酸作為高能磷酸化合物，能刺激突觸囊泡對谷氨酸的攝取和過度釋放，誘導神經毒性[32]。在本研究中，TDCPP染毒組小鼠血清中異亮氨酸顯著降低，谷氨酸、甘氨酸、肌酸和β-葡萄糖顯著升高(P<0.05)，表明TDCPP可能通過影響氨基酸代謝中神經功能相關因子，誘導神經系統功能失調，增加神經性疾病患病風險。

Sethi等[33]研究發現，脂質、膽堿和肌醇等脂質代謝相關因子是精神分裂癥患者血清中主要差異代謝物。TDCPP染毒組小鼠血清中脂質水平顯著升高(P<0.05)，提示脂質代謝可能受到干擾。在脂質代謝中，磷酸膽堿、鯊肌醇和甜菜堿均發揮重要作用。磷酸膽堿是細胞膜磷脂的前體并且與紋狀體脂質周轉相關[34]，膽堿代謝的改變引起神經信號轉導紊亂[29]；鯊肌醇不僅能代謝脂肪和膽固醇，還能減少大腦中β-淀粉樣蛋白濃度和斑塊損傷，改善大腦學習障礙和認知缺陷[35]；甜菜堿能通過提高脂肪分解酶的活性促進脂肪分解，并且能降低血漿中的半胱氨酸濃度，從而減輕由半胱氨酸引起的神經混亂癥狀如抑郁、沮喪等[36]。本研究結果中經TDCPP染毒的小鼠血清中磷酸膽堿和鯊肌醇水平顯著降低(P<0.05)而甜菜堿水平顯著升高(P<0.01)，表明TDCPP染毒引起小鼠體內脂質代謝失衡，可能導致神經信號紊亂和障礙。

綜上所述，小鼠經300 mg·kg-1·d-1的TDCPP持續染毒35 d對腦組織中AChE活性和5-HT含量無顯著影響，但可引起小鼠大腦皮層中神經炎癥和神經營養相關基因表達量改變，成為大腦神經炎癥發生和神經元損傷的潛在誘因；同時TDCPP持續染毒顯著干擾了小鼠的氨基酸代謝、糖類代謝和脂質代謝，引起異亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖等多種神經性疾病相關生物標志物的改變，進一步影響神經系統功能，增加疾病風險。

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