納米TiO2對幼年小鼠血漿代謝譜影響的代謝組學研究

姬海南，李海山，宋乃寧，趙潺，李文濤，徐寶梁，沈國林

中國檢驗檢疫科學研究院化學品安全研究所，北京 100123

TiO2(titanium dioxide, TiO2)，俗稱“鈦白粉”，在食品工業中常作為著色劑用于口香糖、糖果、甜點和沙拉醬等食品[1-2]。相比于常規TiO2，納米TiO2具有粒徑小、白色度高，并可以提高營養物質的吸收率，故納米TiO2已被廣泛開發應用于食品產業鏈的各個環節[3-4]。體內研究表明，納米TiO2可以通過皮膚、呼吸系統和消化道等途徑進入體內，對機體產生毒性[5-6]。納米TiO2可以使小鼠腦組織中的膠質細胞過度增殖同時伴有腦出血現象，并且腦組織出現氧化應激反應[7]。納米TiO2導致大鼠肝臟和腎臟組織出現細胞凋亡以及DNA損傷[8]。目前，納米TiO2的毒性研究主要集中在環境污染物中納米TiO2的肺部吸入是否會導致肺部炎癥和哮喘，及從消化道攝入是否會導致克羅恩病和癌癥的發生[9-10]。有報道指出，兒童每天通過食品攝入體內的納米TiO2量在美國達到2 mg·kg-1bw，而在英國可達3 mg·kg-1bw，約為成年人每日攝入量的3倍～5倍[11-12]。由于，兒童的腸道功能尚未健全，屏障功能弱，納米食品添加劑對其影響更加嚴重[13-14]。這使得納米TiO2對嬰幼兒帶來的安全隱患不斷增大，人們應當對納米TiO2的生物安全性予以重視。

代謝組學研究關注的是生物體系受到外在和內在因素刺激下所導致的內源性代謝產物的變化，可以對那些能夠揭示和描述代謝循環情況的關鍵內源性物質進行定性或定量的分析。血液中含有多種代謝物，能夠較為全面反映生物體的代謝狀況[15]，且血漿樣品的收集方便等特點使操作簡便易行。本研究利用代謝組學技術研究經口攝入納米TiO2對小鼠血漿代謝譜的影響，尋找與納米TiO2相關的生物標志物，揭示小鼠體內可能受到影響的代謝途徑，以期為進一步闡明納米TiO2對機體的毒性作用機制奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

DV215CD型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，MS304TS/02型電子天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司)，88 700V型-80 ℃冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)，UltiMate 3000型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，Q-Exactive型高分辨質譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，Waters C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱(美國沃特世公司)，Milli-QAdvantageA10型超純水儀(美國Millipore公司)，X-30R型離心機(美國西格瑪奧德里奇公司)，乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為色譜純，購于賽默飛世爾科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

ICR幼年小鼠，雌性，周齡3～4周，體質量約10 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，小鼠飼養于SPF級動物房中，適應性飼養一周后按體質量隨機分為對照組和納米TiO2染毒組。該實驗經中國檢驗檢疫科學院化學品安全研究所動物倫理委員會批準，4%的異氟烷麻醉取血，二氧化碳麻醉處死，實驗前禁食24 h，自由飲水。

1.3 染毒實驗

小鼠適應性飼養結束后，設置1個空白對照組和4個染毒劑量組，每組15只，染毒劑量分別為10、30、100和300 mg·kg-1，每天灌胃染毒一次，連續染毒28 d。末次染毒后，4%的異氟烷麻醉取血，于含有肝素鈉的2 mL無菌離心管中3 500 r·min-1離心10 min，取血漿凍存于-80 ℃冰箱。二氧化碳麻醉處死，取心、肝、脾和肺等臟器稱量質量，并計算臟器系數(臟器系數=臟器質量/動物體質量×100%)。

1.4 血漿樣品的高分辨質譜檢測[16]

分析前將血漿樣品于4 ℃冰箱中解凍，取50 μL，加入沉淀劑(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)450 μL(含正內標普萘洛爾10 ng·mL-1和負內標甲苯磺丁脲50 ng·mL-1)，渦流30 s，渦旋混勻60 s，13 000 r·min-1離心10 min，吸取100 μL采用高分辨質譜儀QE-Orbitrap進行檢測。色譜流動相：A為乙腈，B為水(含0.1%甲酸及2 mmoL·L-1甲酸銨)；梯度洗脫：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～60% A；5～8 min，60%～100% A；8～11 min，100% A；11～14 min，100%～60% A；11～15 min，60%～5% A；15～18 min，5% A；柱溫30 ℃，流速0.25 mL·min-1，進樣量5 μL，進樣盤溫度4 ℃。在電噴霧離子源(ESI)正負離子模式下采集數據，噴霧電壓3 kV；蒸發溫度350 ℃；毛細管溫度320 ℃；S-lens RF為50；一級全掃描(full scan)的分辨率為70 000，掃描范圍為70～1 050 (m/z)。二級數據依賴性掃描(full MS/dd-MS2)：分辨率為17 500；AGC target為1e5；Maximun TT為50 ms；NCE為20、40和60。

1.5 小鼠血漿膽汁酸含量的檢測[17]

小鼠血漿50 μL加入含內標的(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)沉淀劑450 μL，渦旋混勻60 s，13 000 r·min-1離心10 min，吸取100 μL進行測定，膽汁酸檢測色譜條件：A為水(含0.1%甲酸)，D為乙腈；梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～0.5 min，30% D；0.5～2.5 min，30%～60% D；2.5～4.0 min，60%～95% D；4.0～6.0 min，95% D；6.0～6.1 min，95%～30% D；6.1～8.0 min，30% D，分析時間0～8 min，每次進樣5 μL，流速為0.3 mL·min-1。色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18 (3 μm，2.1 mm×100 mm)，色譜柱溫度為30 ℃，自動進樣器的溫度保持在4 ℃。膽汁酸檢測在電噴霧離子源(ESI)負離子SIM模式下采集數據，噴霧電壓為2 500 V；蒸發溫度為350 ℃；鞘氣為40 Arb；輔助氣為10 Arb；毛細管溫度為350 ℃；S-lens RF為50。膽酸(CA)為407.28030、脫氧膽酸(DCA)為391.28538、熊脫氧膽酸(UDCA)為391.28538和?；悄懰?TCA)為514.28440。

1.6 代謝通路分析

根據文獻方法鑒定內源性代謝物和處理數據(圖1)[18]。利用Metaboanalyst 4.0分析對照組與納米TiO2不同染毒劑量組小鼠血漿內源性代謝物的差異，找出VIP值>1的內源性代謝物，繪制主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squared discriminant, PLS-DA)以及拓撲分析圖，再利用MetaboAnalyst 4.0網站中的Pathway Analysis分析納米TiO2影響血漿的代謝通路，選擇Impact值>0.1的代謝通路作為納米TiO2影響血漿的主要代謝通路。

1.7 統計學分析

采用Metaboanalyst 4.0進行主成分分析、偏最小二乘判別分析以及拓撲分析，同時分析Impact值>0.1的作為納米TiO2影響血漿的主要代謝通路。相關數據采用SPSS16.0軟件進行數據分析，試驗數據用平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，數據比較采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各實驗組之間的差異，再用Tukey’s test比較各實驗組與對照組之間的差異，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 納米TiO2對ICR幼年小鼠精神狀況、飲食量及臟器系數的影響

納米TiO228 d染毒后，各個染毒劑量組的幼鼠先后出現不同程度的精神萎靡、體質量減輕、進食飲水減少等現象，由表1可知，與對照組比較，隨著劑量的增加小鼠的體質量以及心臟、肝臟和肺臟的臟器系數呈下降趨勢，說明納米TiO228 d染毒后可以影響小鼠自身和臟器正常的生理狀態，而且影響程度隨著染毒劑量的升高而增加。

表1 納米TiO2對小鼠體質量及臟器系數的影響(Mean±SD, n=10)Table 1 The influence of nano-TiO2 on body mass and viscera coefficient of mice (Mean±SD, n=10)

2.2 血漿總離子圖及鑒別方式

采用mzcloud對血漿內源性代謝物質進行鑒定，利用分子式和分子量及二級離子碎片確定內源性物質，同時用TraceFinder軟件進行自建內源性物質[19-20]，血漿樣品總離子圖及鑒別方式如圖1所示。

2.3 納米TiO2對小鼠血漿內代謝的影響

根據文獻方法鑒定內源性物質和處理數據(圖1)[21]，利用Metaboanalyst 4.0中的Statistical Analysis模塊計算PCA和PLS-DA，PCA(圖2(a))和PLS-DA(圖2(b))結果顯示，對照組和納米TiO2不同劑量染毒組血漿之間都能徹底分開，模型質量參數：Accuracy=0.91，R2=0.93，Q2=0.85，即其中93%的變量被作為建立模型的主要成分，91%的樣本符合模型的判別，而模型的預測能力為85%。這表明，幼鼠經不同劑量染毒后，血漿部分內源性代謝輪廓發生改變，從一定程度上說明納米TiO2能夠影響幼鼠機體的代謝輪廓。通過PLS-DA方法對各組的代謝物差異進行分析，選擇VIP值>1的內源性物質作為進一步分析納米TiO2影響血漿代謝通路的種類。由表2可知，血漿中內源性代謝物VIP值>1的總共有49種，其中，31種內源性物質的比例主要是上升，另18種主要呈下降趨勢。由表3可知，與對照組相比，各個染毒劑量組中的?；悄懰?、膽酸、脫氧膽酸和熊脫氧膽酸均升高。以上結果表明納米TiO2影響了小鼠血漿內源性物質的代謝分泌，使它們的含量發生明顯變化。

表2 幼鼠血漿主要差異性標志物的平均變化Table 2 Average changes of major plasma differential markers in young mouse

表3 不同劑量納米TiO2對血漿膽汁酸濃度的影響(Mean±SD, n=5)Table 3 The changes of bile acid concentration in plasma under the influence of different doses of nano-TiO2(Mean±SD, n=5)

圖1 全掃描檢測幼鼠血漿總離子流圖及纈氨酸鑒別模式識別注：(a)正離子模式下的色譜圖；(b)負離子模式下的色譜圖；(c)纈氨酸色譜圖；(d)纈氨酸相應的精確質量數和分子式。Fig. 1 Full-scan detected total ion maps and valine identification pattern recognition of young mice plasmaNote: (a) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the positive ion scanning; (b) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (c) Valine chromatogram; (d) The exact mass and molecular formula of valine.

圖2 高分辨質譜QE-Orbitrap檢測的代謝組學數據分析注：(a) PCA模型分析，(b) PLS-DA分析；A為對照組，B為10 mg·kg-1納米TiO2染毒組，C為30 mg·kg-1納米TiO2染毒組，D為100 mg·kg-1納米TiO2染毒組，E為300 mg·kg-1納米TiO2染毒組。Fig. 2 Analysis of metabonomics data detected by high resolution mass spectrometry QE OrbitrapNote: (a) PCA model analysis, (b) PLS-DA analysis; A represents control group; B represents 10 mg·kg-1 nano-TiO2 group; C represents 30 mg·kg-1 nano-TiO2 group; D represents 100 mg·kg-1 nano-TiO2 group; E represents 300 mg·kg-1 nano-TiO2 group.

2.4 納米TiO2對小鼠血漿內源性物質代謝通路的影響

如圖3和表4所示，血漿內源性物質相關代謝通路受到納米TiO2影響的主要有6條，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、煙酸酯和煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、醚脂質代謝(ether lipid metabolism)和甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)等，以上結果說明，納米TiO2染毒28 d后主要影響小鼠血漿中氨基酸和脂肪酸的合成和代謝，從而導致小鼠血漿中內源性物質含量的變化。

表4 用MetPA構建分析通路結果Table 4 Result from pathway analysis with MetPA

圖3 使用MetPA數據庫構建重要內源性小分子相關代謝通路Fig. 3 The pathway analysis summary diagram obtained by MetPA

2.5 差異性內源性物質相關性和分層聚類分析

血漿中差異性內源性物質相關性分析結果如圖4(a)所示，圖中水平軸和垂直軸均代表變量信息，顏色越深反映相關性越強，顏色越淺反映相關性越弱，紅色表示正相關，綠色表示負相關，根據圖4(a)可知差異性內源性物質之間的相關性。從水平軸看，在同一小分支下的物質的正相關性最強，即某一個物質含量升高或者降低，則與之相關性強的物質會隨之升高或降低。分層聚類分析獲得的熱圖如圖4(b)所示，圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息。顏色深淺反映變量值大小，紅色表示含量升高，綠色表示含量降低，顏色越深表明變化量越大，從圖4(b)圖中可直觀看出49種差異性內源性物質在各組間的含量變化趨勢。以上結果進一步證明染毒28 d后納米TiO2影響了小鼠血漿內源性物質含量。

圖4 應用相關性分析與分層聚類分析法分析血漿數據Fig. 4 Plasma data were analyzed using correlation analysis and hierarchical clustering

3 討論(Discussion)

磷脂不僅是細胞膜和各種細胞器(線粒體、內質網和細胞核等)膜的重要組成成分，還參與調節生物體內的許多重要功能，如神經傳導、降血脂和降低膽固醇等[22]，由代謝通路拓撲分析結果可知，納米TiO2影響了小鼠機體的磷脂代謝(Impact值>0.1)。如表2所示，與甘油磷脂代謝通路相關的差異性標志物中，不同劑量染毒引起了細胞內膜主要組成成分磷脂酰膽堿(PCs)及其水解產物溶血磷脂(LysoPCs)發生異常變化，而且隨著染毒劑量的增加變化更顯著，表明小鼠全身PCs和LysoPCs的代謝發生異常，文獻報道溶血磷脂含量的升高會導致細胞膜流動性增強，從而影響膜脂蛋白的有序性，破壞細胞膜結構，進而導致細胞死亡[23]，這表明納米TiO2對機體的毒性作用可能與LysoPCs的升高有關。此外，細胞外膜的主要組成成分鞘磷脂(SMs)的水平在不同染毒劑量組中均呈現顯著升高趨勢，表明小鼠全身SMs的代謝降解可能被抑制。與對照組相比，溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPEs)的比例隨著染毒劑量的升高均明顯降低，表明納米TiO2可能抑制了全身磷脂酰乙醇胺(PEs)水解生成LysoPEs的反應。以上結果證實了納米TiO2將影響小鼠磷脂類的代謝。

筆者前期研究發現，納米TiO2染毒導致部分LysoPCs含量升高，溶血磷脂酰膽堿是磷脂酶A2作用于磷脂酰膽堿的產物，磷脂酰膽堿主要來源是食物和膽汁分泌的磷脂。文獻報道健康人每天經膽道分泌大量的磷脂酰膽堿必須經水解釋放，最終以溶血磷脂酰膽堿的形式被腸道吸收入血形成腸肝循環[24]，說明膽汁是磷脂類物質主要來源之一。膽汁酸由膽固醇在肝細胞中轉化而來，是膽汁的主要成分。其在體內的合成、轉運受到多種因素的調節[25]。筆者研究發現，當小鼠暴露于納米TiO228 d后，與對照組相比，隨著染毒劑量的增加血漿中膽酸的比例呈上升趨勢(表2)，通過定量檢測發現血漿中膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸和牛磺膽酸的含量都呈上升趨勢(表3)，說明納米TiO2可以引起肝臟膽汁酸代謝的變化，相關研究表明膽汁酸可以作為生物標識物用來表征肝臟毒性[26-27]，由此推斷膽汁酸(膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸和?；悄懰?可以作為納米TiO2引起小鼠肝臟毒性的生物標志物。

◆