DINP的健康效應及機理研究進展

孫蕾，李洪祥，劉敏，葉婷，王佳,*

1. 山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)，泰安 271016 2. 貴陽學院，貴陽 550005

鄰苯二甲酸二異壬酯(di-isononyl phthalate, DINP)是一種高分子量的人工合成增塑劑，95%添加于常見的聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)塑料制品中增加塑料的可塑性和耐久性，包括食品包裝、化妝品、玩具、油漆、聚氯乙烯地板、潤滑油和粘合劑等[1]。DINP與塑料基質以非共價形式結合，易釋放到環境中，并通過呼吸吸入、皮膚接觸和飲食攝入等多種途徑被人體吸收[2-3]。動物實驗以及流行病學研究發現，DINP具有危害內分泌系統、生殖發育系統、皮膚、消化系統、神經系統、呼吸系統和免疫系統等多種毒性作用[4]。DINP等增塑劑污染已成為威脅人類健康的重要問題，受到國內外越來越多的關注。美國環境保護局(US Environmental Protection Agency, US EPA)已將包括DINP在內的多種鄰苯二甲酸鹽列入潛在內分泌干擾物清單[5]。我國積極修訂中華人民共和國國家標準《玩具安全 第1部分：基本規范》(GB 6675.1—2014)，控制DINP在兒童護理用品及玩具中的添加量[6]。

本文結合國內外文獻，從一般毒性、內分泌毒性及生殖發育毒性等角度系統地對DINP的毒性作用及機制研究進行綜述，為DINP的健康風險評估及毒理學研究提供依據和參考。

1 DINP的人體暴露與代謝(Human exposure and metabolism of DINP)

隨著PVC塑料制品的使用，DINP不斷進入生態環境中，DINP可通過消化道、呼吸道和皮膚接觸多種途徑進入人體，嬰幼兒、兒童由于接觸塑料玩具等制品，DINP暴露量通常高于成人[7]。Al Qasmi等[8]研究了卡塔爾11個家庭及1個醫院室內粉塵中的鄰苯二甲酸鹽濃度，發現家庭DINP濃度中值為101 μg·g-1，占總鄰苯二甲酸鹽的23%；醫院大樓DINP濃度中值為19 626 μg·g-1，占總鄰苯二甲酸鹽的94%；進一步研究了成人、嬰幼兒體內的非飲食暴露量，發現嬰幼兒每日暴露量(1 736 ng·kg-1)遠高于成人(225 ng·kg-1)，其原因可能是嬰幼兒比成人更容易通過地板灰塵接觸鄰苯二甲酸酯、嬰幼兒體表面積與體積之比高于成人以及他們之間行為和生理差異。Zhang等[9]對中國天津市和滄州市農村家庭室內塵埃中鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)的含量進行了研究，發現天津市家庭室內塵埃中PAEs的含量遠高于滄州市農村地區；DINP、DEP和DNBP的濃度中值分別為0.28、0.31和42.6 μg·g-1，且DINP濃度與現代地板材料(膠合板/木地板)的使用密切相關(P<0.05)。

DINP在一期代謝過程形成初級代謝物水解單酯，進一步經過氧化反應生成次級代謝物鄰苯二甲酸單羧基異辛酯(MCIOP)、鄰苯二甲酸單羥基異壬酯(MHINP)和鄰苯二甲酸單異壬酯(MOINP)。人類生物監測研究表明，幾乎所有受試尿液樣本都檢測到DINP的主要代謝產物MHINP，只有約10%的樣本檢測到初級代謝物鄰苯二甲酸單(3,5,5-三m乙基己基)酯(MiNP)，表明次級代謝產物可作為檢測DINP暴露的敏感生物標志物[10]。Iwata等[11]進行DINP藥物代謝動力學研究，發現人源化肝臟小鼠與對照組TK-NOG小鼠的主要循環代謝產物不同，分別是MiNP的氧化產物(羧基MiNP、羥基MiNP和氧代MiNP)及其葡萄糖醛酸苷和MiNP，表明不同物種肝臟代謝的差異可能是影響DINP在體內代謝處置的決定因素。

2 DINP的健康效應(Health effects of DINP)

2.1 內分泌毒性作用

動物實驗研究表明，DINP存在明顯的內分泌干擾活性作用。Forner-Piquer等[12]研究了DINP對成年雄性吉列海鯛內分泌功能的影響，考察了DINP對內源性大麻素系統(endocannabinoid system, ECS)的調節作用。結果表明，DINP通過參與脂質生物合成影響ECS代謝基因轉錄水平，進而改變肝臟內大麻素和大麻素樣介質的水平使得成年雄性吉列海鯛的內分泌調節紊亂。食用DINP的海鯛肝臟結構和生化成分發生了改變，脂質和甘油三酯的含量增加，糖原和磷脂的含量降低。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen[13]利用甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)依賴性大鼠垂體GH3細胞增殖實驗研究了DINP、鄰苯二甲酸(2-乙基己基酯)(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(diisodecyl phthalate, DIDP)、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate, DOP)和鄰苯二甲酸丁基芐酯(butyl benzyl phthalate, BBP)等6種增塑劑的甲狀腺激素干擾活性作用，并利用雌激素受體(estrogen receptor, ER)熒光素酶報告載體穩定轉染的MVLN細胞分析了這些增塑劑的雌激素干擾活性作用，發現這些增塑劑具有內分泌干擾作用，此作用是通過干擾雌激素和甲狀腺激素系統進行調節的。Duan等[14]對自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid diseases, AITD)模型大鼠腹腔注射不同濃度DINP，研究發現，高劑量DINP(1.5 mg·kg-1和15 mg·kg-1)暴露加劇氧化應激，激活Akt/mTOR信號轉導通路，進而抑制正常自噬過程、促進甲狀腺中IL-17高表達，加劇了自身免疫性甲狀腺疾病。

2.2 生殖發育毒性作用

越來越多的證據表明，DINP具有危害生殖健康的毒性作用。流行病學研究發現，男性在出生前、后接觸鄰苯二甲酸鹽與生殖發育異常密切相關，可能是DINP強烈的抗雄激素作用所致[15]。國內外動物實驗研究表明，DINP可引起大鼠/小鼠睪丸組織病理學損傷及生理生化指標改變。Borch等[16]用DINP(750 mg·kg-1)對妊娠期和哺乳期大鼠每天進行灌胃處理，結果顯示，妊娠第21天雄性子代睪丸和血漿中睪酮水平降低。陳瑩瑩等[17]研究發現，20 mg·kg-1或更高劑量的DINP灌胃處理導致成年昆明系雄性小鼠(23～25 g)睪丸組織病理損傷，損傷程度與暴露劑量呈正相關。DINP對雌性的影響具有雙重性，低劑量時主要干擾類固醇的生成和卵母細胞生長，而高劑量則影響卵母細胞的成熟[18]。Boberg等[19]對妊娠期Wistar大鼠進行DINP灌胃處理(妊娠第7天至產后第17天)，利用Morris水迷宮研究發現，DINP暴露影響子代大鼠的空間學習能力，并導致雌性子代的行為具有雄性化特征。對于亞慢性接觸DINP的研究，Chiang和Flaws[20]對成年CD-1雌性小鼠連續灌胃DINP(20 μg·kg-1～200 mg·kg-1)10 d，分別在給藥結束后、3個月后和9個月后與雄鼠配對進行育種試驗，結果顯示，DINP暴露對雌性小鼠生殖系統有不利影響(包括生殖器官重量變化、動情周期中斷、生育力降低、交配行為變化以及產仔結果的變化)。目前，人們可在較短時間內通過檢測鄰苯二甲酸鹽暴露的敏感生物標志物測定人體暴露于DINP引起的生殖發育方面的影響[15]。

另外，DINP暴露還會對腸道及骨骼發育產生不利影響。Setti等[21]用DINP(380 mg·kg-1)對Wistar雌性大鼠(妊娠第8天到出生后第30天)灌胃處理，發現DINP處理組大鼠機體和器官的質量顯著降低(P<0.001)，且十二指腸中缺乏腸腺，小腸絨毛萎縮嚴重。Carnevali等[22]采用DINP污染的飼料喂養烏頰魚并觀察對其肌肉大分子組成和質地變化的影響，發現DINP(15 μg·kg-1)暴露引起飽和鏈和不飽和鏈甘油三酯減少、脂肪含量降低、鈣蛋白和組織蛋白酶水平降低、協調蛋白的轉換紊亂，這表明DINP污染的飲食會導致骨骼肌成分和質地改變。

2.3 免疫毒性

流行病學調查研究表明，接觸鄰苯二甲酸鹽會促進兒童過敏性疾病發展[23]，增加患過敏性皮炎的概率，甚至使其變為易感染體質或加重病情[24]。動物實驗研究表明，DINP可以加劇小鼠過敏性皮炎癥狀。Kang等[25]研究發現，經口攝入DINP加重異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)引起的小鼠變應性接觸性皮炎，促進小鼠皮膚水腫加重，血清總免疫球蛋白E和輔助性T細胞(helper T cell, Th)2增加，這種促皮炎作用通過核因子κb(nuclear factorκB, NF-κB)信號通路調節。張煥云等[26]研究發現，小鼠經皮膚持續暴露于DINP(14 mg·kg-1和140 mg·kg-1)40 d，加重了由FITC和DBP混合致敏劑引起的機體氧化應激和炎癥反應，且呈劑量依賴性，表明DINP對小鼠過敏性皮炎有明顯的佐劑作用。另外，DINP與過敏性哮喘的疾病發展密切相關。Li等[27]研究發現，Balb/c小鼠經口飼喂DINP(2～200 mg·kg-1)與卵清蛋白(ovalbumin, OVA)15 d，誘導氣道高反應性，加重氣道壁重塑，該癥狀與免疫球蛋白E和Th2細胞因子分泌增加有關，表明DINP可以影響肺功能、引起肺組織病理學變化、誘導免疫分子表達及引起肺組織氧化損傷，從而與OVA協同(或佐劑作用)促進過敏性哮喘的免疫應答，并推測DINP的佐劑效應可能是由Th1/Th2免疫應答失衡引起的。

2.4 心血管毒性

近年來，有關PAEs與心血管危險因素(如肥胖、Ⅱ型糖尿病和高血壓)關系的研究越來越多[28]。已有研究發現，PAEs通過其與過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARγ)受體的結合和激活導致脂肪細胞生成的上升，從而導致肥胖。DEHP的主要代謝物鄰苯二甲酸單乙基己基酯(mono-2-ethylhexyl phthalate, MEHP)直接結合并激活PPARγ受體，從而促進脂肪生成；PAEs干擾胰島素信號通路，促進氧化應激，誘導胰島素抵抗的發生；對2003—2008年參與美國健康與營養調查的6～19歲兒童的研究表明，DEHP暴露與血壓密切相關。DEHP的代謝物鄰苯二甲酸單芐酯(monobenzyl phthalate, MBzP)以及DBP的代謝物鄰苯二甲酸單乙酯(monoethyl phthalate, MEP)與舒張壓密切相關。最近研究表明，PAEs在動脈粥樣硬化和高血壓發病過程中起重要作用，PAEs相關的高血壓可能與動脈粥樣硬化斑塊回聲增加、內膜中層增厚和回聲增加有關[28]。血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)屬于G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族成員，AT1R的激活能誘發高血壓、動脈粥樣硬化及心衰等心血管疾病[29]。Deng等[30]發現C57/BL6小鼠經口及皮下注射方式暴露于DINP(0.15～15 mg·kg-1)6周后，血管緊張素轉化酶表達增加，AT1R受體活化，eNOS的表達降低和NO的生成減少，血管阻力增加，增強血管收縮，進而引起血壓升高。PAEs暴露對心血管健康的影響與機制仍需進一步研究。

2.5 神經毒性

人類神經系統中的成熟神經元不能增殖以進行自我修復，因而很容易受到環境污染物的影響。盡管DINP暴露相關的其他毒性效應研究較多，但神經毒性作用研究較少。Ma等[31]研究了口服DINP對5～6周齡昆明鼠的神經毒性作用，通過Morris水迷宮實驗及曠場試驗發現，DINP(20 mg·kg-1和200 mg·kg-1)可引起小鼠運動減少、認知缺陷及焦慮等行為學改變；腦組織病理學研究表明，DINP顯著增加小鼠腦組織中腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β水平，誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，并引起小鼠大腦海馬CA1區錐體細胞損傷、腦細胞凋亡增加，細胞損傷的表現包括導致細胞排列松散無序、細胞形狀腫脹變形、頂樹突縮短甚至消失和尼氏體減少等；免疫組化結果顯示，DINP引起半胱氨酸蛋白酶-3在CA1區和大腦皮層的表達均增加，星形膠質細胞標志物GFAP的表達急劇增加，激活了星形膠質細胞，改變了運動神經元的形狀和功能，從而，炎癥的增加引發氧化應激并最終導致小鼠腦損傷及行為改變。

3 DINP的毒作用機理(Toxic effect of DINP and its mechanism )

3.1 DINP活化NF-κB，促進ROS生成

NF-κB是許多信號通路中的關鍵因子，比如炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡等。NF-κB通路的激活與內分泌有關且能促進炎癥因子的表達[32]。Kang等[33]研究發現，小鼠經FITC致敏的同時經口暴露DINP，激活NF-κB信號通路促進胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)的生成，進而激活瞬時受體電位錨蛋白1(transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1)的活性，提高TRPA1表達，促進IL-6和Th2等細胞因子的分泌，從而加劇小鼠過敏性皮炎癥狀。另外，他們發現DINP與FITC混合暴露能促進ROS生成，激活轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT 3)、STAT 5和STAT 6，進而開啟致敏過程、加重變態反應性皮炎[24]。Duan等[32]研究發現DINP和甲醛均可引起氧化應激及NF-κB活化，從而導致腦內促炎癥因子表達增加，加重大腦神經炎癥。

3.2 DINP調節Th1/Th2平衡

輔助性T細胞可分泌細胞因子并參與人體多種免疫，其中Th1介導細胞免疫，Th2介導體液免疫，Th1/Th2在體內處于動態平衡，從而保證人體免疫系統處于平衡狀態。當有病原菌侵入時，Th1/Th2平衡發生相對偏移，導致人體免疫傾向于細胞免疫或者體液免疫，達到殺滅病原體的作用，之后再分泌有抑制作用的細胞因子，使之恢復平衡，防止免疫作用擴大。Hwang等[34]研究發現，DINP通過調節Th1/Th2平衡誘導哮喘發生，DINP促進CD4+T細胞對Th2的極化、抑制Th1極化，打破Th1/Th2平衡進而誘導哮喘。另外，DINP可誘導Th2型免疫應答相關細胞因子(IL-4和IL-5等)及免疫球蛋白(IgE和IgG1)表達增加，降低Th1應答相關的IFN-γ和IgG2a水平，并且促進炎癥細胞浸潤和過碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff stain, PAS)陽性的杯狀細胞增生，誘導半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1和caspase-3的表達，從而誘導氣道炎癥。

3.3 DINP激活PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路

磷酸肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號通路參與調控細胞的存活、生長增殖、遷移及糖代謝等過程。Chen等[35]研究發現，DINP(50 mg·kg-1)促進幼鼠肺阻力增加、Akt磷酸化和NF-κB核轉位增強，Th2細胞因子水平增加，這表明DINP通過激活PI3K/Akt信號通路提高Th2細胞因子水平，進而增強OVA誘導的過敏性氣道反應。哺乳動物的mTOR可負調控甲狀腺細胞的自噬，Akt/mTOR通路可直接調控自噬。DINP(15 mg·kg-1)抑制甲狀腺細胞的正常自噬和IL-17的表達，提高甲狀腺中ROS水平加重氧化應激，激活Akt/mTOR通路，進而加重自身免疫性甲狀腺疾病，采用維生素E阻斷氧化應激或Akt/mTOR通路阻斷劑雷帕霉素可減輕自身免疫性甲狀腺病(AITD)的病情和抑制正常的自噬作用[14]。

3.4 DINP影響內源性大麻素系統

內源性大麻素系統(endocannabinoid system, ESC)是細胞內一種信號系統，影響睡眠、食欲、疼痛、炎癥、記憶、情緒和生殖等，有助于調節人體所有主要系統的平衡，確保所有系統能彼此協同工作。隨著脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase, FAAH)活性的增加，DINP(1.5 mg·kg-1)降低了內源性大麻素和內源性大麻素類介質的水平，通過降低11-酮基睪酮(11-ketotestosterone, 11-KT)顯著影響類固醇生成，從而在繁殖季節對雄性平頭海燕的內分泌系統產生不利影響[36]。

4 總結展望(Conclusion and prospects)

塑化劑DINP的暴露在人類整個生命周期中廣泛存在，DINP能通過激活NF-κB、促進ROS生成、調節Th1/Th2平衡、激活PI3K/Akt/mTOR信號通路等過程作用于人體，在一定程度上對機體的生殖發育系統、內分泌系統、心血管系統、免疫系統和神經系統等產生不利影響，減少DINP暴露對于降低上述系統疾病發病率具有重要意義。目前有關DINP毒性及其機理的研究存在以下問題。(1)DINP是生活用品中常見的添加物，因生殖毒性等毒性作用顯著低于DEHP和DBP等被認為是安全的；雖然DINP生物半減期短、短時間內低劑量接觸對機體無明顯的不利健康影響，但長期接觸使用含有DINP的物品可能對機體健康造成潛在風險。(2)與DEHP等鄰苯二甲酸酯類物質相比，DINP相關的體內、外研究較少，并且缺乏人群暴露控制實驗研究；加強DINP重復暴露及重復健康隨訪之間關系的縱向研究，可能為DINP暴露對人體健康(如心血管健康等)的影響提供有力證據。(3)DINP暴露所致有害作用的最低劑量和安全限值尚未確定，尤其嬰幼兒產品及職業環境中DINP的安全限值亟待確定。(4)DINP是否具有特殊毒性作用目前尚無報道。因此，有必要針對DINP的毒作用及機理開展進一步動物實驗研究及人群流行病學研究，建立健全DINP環境暴露相關衛生標準，為DINP相關疾病的防治提供更多的科學證據。

◆