Lactacystin對卵巢癌SKOV3細胞作用及機制的研究

秦 瑞，田秀娟，曹 璐

(吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033)

卵巢癌是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤，病情進展快，早期診斷較為困難，復發率高，死亡率高，卵巢癌通常發生于絕經期婦女中。卵巢癌的發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，在女性癌癥中排名第三。大約60%-70%的卵巢癌患者在診斷時已經進入Ⅲ-Ⅳ期或發生腹部轉移。卵巢癌通常是在早期和無癥狀在后期患者將有腹脹，腹部腫塊，胃腸道癥狀和相關的腫瘤浸潤或壓迫癥狀。盡管手術，放療，化療等治療方法得到了持續改善，但生存率仍在30%左右，后期效果較差。卵巢癌如果在早期得到及時的診斷，手術治療作為早期卵巢癌的一種主要的治療方法，可以取得較好的臨床效果，但對于很多復發的患者以及晚期的患者尚不能取得很好的效果，故化學藥物治療尤為重要。然而，傳統的化療藥物是日益嚴重的耐藥性的限制和缺乏選擇性，因為它是不可能滿足的良好的治療效果的需求，克服了傳統化療的各種缺點的影響它已成為越來越重要的是找到一種替代藥物。這種替代藥物成為目前實驗室研究卵巢癌及臨床治療卵巢癌的新靶點、新方向[1-3]。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器人卵巢漿液性囊腺癌乳頭狀(SKOV3)細胞系和蛋白酶體抑制劑乳胞素通過吉林大學白求恩醫學藥理研究所提供，總RNA提取試劑盒及Taq酶預混液購自Promega公司，cDNA一鏈合成試劑盒、RT-PCR試劑盒、PVDF膜購自Roche公司，引物合成及測序由上海生工生物工程技術服務公司完成，其它化學試劑均為常規分析純產品。全自動顯微鏡數碼及光學攝像系統和相差顯微鏡均購自日本 OLYMPUS公司，流式細胞儀購自美國B.D公司，PCR熱循環儀、電泳儀購自日本Takara公司。

1.2 MTT凍存SKOV3細胞復蘇后，傳代培養，取處于對數生長期細胞，接種上5×104/ml的密度的細胞于96個孔培養板中。培養24 h后，加入0，2.5，5.0，10.0 μmol/ L LAC并繼續培養48 h。添加20 μl的MTT到每個孔中作用時間為4 h，除去上清液，加入150 μl DMSO[4]到每個孔中，測定吸光度490 nm處的吸收(A)，計算每個組中細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗組值/ A值對照組)×100[4]，每組重復6孔,實驗重復3次[2]。

1.3 FCM經上述分組及處理后，各組用均胰酶消化處理，制成細胞懸液(濃度為1×106個/ml)，吸取1 ml，離心10 min，溫度為4℃，轉速為1 000轉/min，棄上清;加入1 ml已預冷PBS，震蕩，使細胞懸浮充分混勻，再次離心10 min，溫度為4℃，轉速為1000轉/min，棄去上清(此兩步驟重復兩次)，將細胞重懸于500 μl的Binding Buffer溶液中，加入 PI染色液5 μl，震蕩，充分混勻，在避光室溫下反應15 min[5]。使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，重復3次,取其平均值[5]。

1.4 Western blot提取總蛋白，測定蛋白濃度，將所得樣品的蛋白濃度稀釋到1 μg/μl后，SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，封閉1 h后，孵一抗、二抗，顯色，顯色結束后，應對各個顯色膠片拍照，用軟件分析各組條帶的灰度值，根據各組顯像的差異，分析每組細胞內Bcl-2及 Bax蛋白表達水平。

1.5 RT-PCR提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，向PCR儀分別加入12.5 μl Takara Taq酶、1 μl模板cDNA、1 μl引物、10.5 μl雙蒸水。擴增條件：變性2 min，94 ℃；復性30 s，內參照GAPDH基因擴增引物(擴增片斷長617 bp，退火溫度57℃)，Bcl-2基因擴增引物(擴增片斷長723 bp，退火溫度64℃)，Bax基因擴增引物(擴增片斷長468 bp，退火溫度58℃),延伸30 s，72℃下,供需約10 min，進行30個循環[3]。各組反應后的PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像系統AlphaimagerTM 2200，以確認每個組PCR反應產物的含量，拍照并保存，分析電泳帶的光密度值，利用靶基因GAPDH作為內部參考圖像計算Bcl-2和Bax在不同組的含量，重復每次實驗3次，取平均值。

2 結果

2.1 MTT檢測結果顯示SKOV3細胞的增殖可被LAC有效的抑制，LAC作用濃度升高可明顯提高對于SKOV3細胞的增殖的抑制，LAC 2.5 μmol/L 組細胞存活率為(42.5±0.09%)，5.0 μmol/L組細胞存活率為(29.2±0.12%)，而10.0 μmol/L細胞存活率下降至(18.9±0.13%)，與對照組相比，差異有統計學意義，P<0.05。

2.2 流式細胞儀檢測結果顯示在相同作用時間條件下，LAC可促進SKOV3細胞的凋亡，LAC 2.5 μmol/L組卵巢癌SKOV3細胞凋亡率為(34.5±0.09%),且LAC作用濃度升高可明顯提高SKOV3細胞的凋亡率，當LAC 為5.0 μmol/L時，SKOV3細胞凋亡率增加至(52.2±0.10%)，LAC為 10.0 μmol/L時，SKOV3 細胞凋亡率達到(68.9±0.11%)，與對照組相比，P<0.05。

2.3 不同濃度LAC作用于 SKOV3細胞后Bcl-2、Bax蛋白表達情況分別用濃度為2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L的LAC處理SKOV3細胞，Western Blot分析結果，Bax蛋白在卵巢癌SKOV3細胞內的表達水平隨LAC作用濃度的升高而逐漸增強，而Bcl-2蛋白的表達水平逐漸減弱，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。 如圖1所示。

2.4 不同濃度 LAC作用于SKOV3細胞后Bax、Bcl-2 mRNA表達情況分別用濃度為2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L的LAC處理SKOV3細胞，RT-PCR結果顯示，Bax mRNA在卵巢癌SKOV3細胞內的表達水平隨著LAC濃度的升高而逐漸增強，而Bcl-2 mRNA的表達水平呈遞減趨勢，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。如圖2所示。

圖1 不同濃度LAC組Bcl-2及Bax蛋白表達水平(μmol/L) 圖2 不同濃度LAC組Bcl-2及Bax mRNA表達水平(μmol/L)

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤中的三種嚴重癌癥之一。當前，外科治療，化學療法，放射療法，生物靶向療法和其他技術已經得到改善。因此，早期診斷和治療非常重要。近年來，國內外許多學者探索了通過多種方法早期診斷卵巢癌的方法和指標。

近年來，人們逐漸向細胞水平和分子領域進行探索，分子靶向治療、基因治療等已經成為治療惡性腫瘤的新方向，而Lactacystin作為一種新興的分子靶向治療的藥物，作為蛋白酶體抑制劑的一種，作為泛素-蛋白酶體通路的抑制劑，是腫瘤治療中最有前景的研究點[3,6]。在所有真核細胞中大多數蛋白質，包括人遍在蛋白的降解-通過蛋白酶體途徑進行的，許多細胞增殖，分化的生長，凋亡與該途徑[7]相關聯。研究表明Lactacystin能夠抑制癌細胞增殖，其抗腫瘤活性取決于對UPS的抑制，UPS可控制細胞蛋白質的更新。同時Lactacystin也可以阻滯一些腫瘤細胞的細胞周期進程。近期的臨床研究表明，Lactacystin可有效治療血液惡性腫瘤。細胞培養和動物模型的臨床前研究也已經確定了蛋白酶體抑制劑對包括黑素瘤在內的許多類型癌細胞的抗腫瘤潛力[8-13]。本實驗首先體外培養卵巢癌SKOV3細胞,檢測了不同濃度LAC對卵巢癌SKOV3細胞增殖抑制率及凋亡率的影響[4]，結果表明：SKOV3細胞的增殖可被LAC有效的抑制，LAC作用濃度升高可明顯提高對于SKOV3細胞的增殖的抑制,且LAC作用濃度升高可明顯提高SKOV3細胞的凋亡率，其機制與上調Bax表達、下調Bcl-2表達有關，Bax及Bcl-2是參與細胞周期調控的、與腫瘤細胞凋亡密切相關的重要蛋白[14]，因此，我們推測，LAC抑制SKOV3細胞增殖,并誘導其凋亡的主要機制可能是通過引起Bax、bcl-2等細胞凋亡相關基因及蛋白的表達失衡而抑制泛素-蛋白酶體通路的活性有關。蛋白的抑制劑可阻斷泛素-蛋白酶體通道，選擇性地殺死腫瘤細胞，有效地防止腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞[15]，增加其它化療藥物因敏感性的細胞凋亡和逆轉多藥耐藥性。作為治療惡性腫瘤的一種新的有效方法[3,16]。