克敏芪丹鼻噴劑對氣虛血瘀證變應性鼻炎大鼠血清IL-4、PAF的影響①

慕德宏 劉慧霞 李東棋 劉 婷 丁 鵬 田 理

(成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072)

過敏性鼻炎西醫學又稱為變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，是IgE介導的與過敏原相關的非特異性炎癥[1]。流行病學研究表明，AR發病率逐年上升，影響全世界高達40%的人口[2]。AR易復發、易伴隨并發癥，是變態反應性疾病研究熱點，已成為全球性健康問題。鼻噴劑是臨床治療AR的重要劑型之一，《靈樞·雜病第二十六》即有提及“哆以草刺鼻，嚏而已”，吳師機所撰《理瀹駢文》已形成較為完整的鼻腔給藥理論體系，其“外治之理即內治之理”為克敏芪丹鼻噴劑治療AR提供了理論基礎。純中藥克敏芪丹鼻噴霧劑(益氣活血法)是田理教授基于“肺心同治”和經驗方劑治療AR的有效方劑，臨床研究表明其對AR癥狀控制及預防復發有顯著優勢，為開發純中藥鼻用新制劑奠定了基礎[3]。本實驗采用克敏芪丹鼻噴霧劑治療氣虛血瘀證AR大鼠，對克敏芪丹鼻噴霧劑的作用機制，并對其藥物組成進行簡單探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 7～8周齡SPF級SD大鼠65只，體質量(230±10)g，由成都達碩動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。(23±2)℃、相對濕度(50±5)%條件下飼養，保持室內安靜，適應性喂養1周后進行實驗。

1.1.2藥物 卵清蛋白(OVA，批號：A5503-5G，1 g/瓶)購自Sigma-Aldrich公司；氫氧化鋁購自哈藥集團生物制藥有限公司；克敏芪丹鼻噴劑由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供；內舒拿鼻噴劑購自默沙東公司。

1.1.3試劑與儀器 0.5%OVA Al(OH)3溶液配制：稱取卵清蛋白50 μg+氫氧化鋁粉末5 mg+生理鹽水1 ml混勻備用；0.6%OVA生理鹽水配制：稱取60 mg OVA至10 ml生理鹽水中，混勻備用。IL-4和PAF ELISA試劑盒購自ThermoFisher公司；全自動血流變儀購自北京普利生儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1氣虛血瘀證AR大鼠模型的建立及分組 大鼠造模分為冷水力竭游泳制造氣虛血瘀證及腹腔注射與鼻腔滴注OVA激發AR 2個階段[4]。采用游泳力竭法+寒濕+高脂飲食法構建氣虛血瘀證模型，先將大鼠進行為期1周的游泳訓練，2 d/次，2～3 min/次，以適應游泳環境。8℃冷水進行力竭游泳造模，連續14 d，力竭標準為全組50%大鼠出現自然沉降，達標后全組大鼠停止游泳，同時高脂飼養。14 d后，大鼠毛色發黃，毛發粗糙，體型瘦弱，情緒暴躁，大便松散不成型；無創血壓儀測量大鼠收縮壓(systolic pressure，SBP)、平均動脈壓(mean blood pressure,MBP)和舒張壓(diastolic pressure,DBP)均不同程度地下降。大鼠由于長時間游泳體力消耗，腦組織處于嚴重缺氧狀態，長久致氣虛；因處于冷水環境中，血液遇寒則凝，致血瘀；氣行血，氣虛無力推動血液運行致血瘀。

腹腔注射0.5%OVA Al(OH)3混懸液誘導過敏，2 d/次，共14 d；空白組給予Al(OH)330 mg+生理鹽水1 ml混懸液，2 d/次，共7次。全身抗原攻擊完成后，滴鼻給予0.6%OVA生理鹽水，每只每側50 μl，1 d/次，共7次。空白組給予等量生理鹽水。30 min內觀察大鼠是否出現搔鼻、噴嚏、鼻溢液及覓食等行為。造模完成后觀察大鼠有無懶動、脫毛、易驚、便溏、舌底紫暗、眼球暗紅等氣虛血瘀癥狀及撓鼻、打噴嚏、流涕等AR癥狀，空白組和模型組各取5只大鼠抽血檢測血液流變學指標。根據鼻部癥狀評分標準對鼻炎癥狀進行評分:鼻癢，輕擦鼻，記1分;到處摩擦，抓撓鼻、面部不止，記2分;噴嚏1～3個記1分，4～10個記2分，11個以上記3分;鼻涕流至前鼻孔記1分，超過前鼻孔記2分，流涕滿面記3分[5]。通過舌色和舌底靜脈長度觀察舌狀態。無紫暗，舌底色微青、舌靜脈主干長度不超過3/4,記0分;輕度紫暗，舌底色紫暗或舌靜脈主干長度超過3/4,記1分;明顯紫暗，舌底色紫暗且舌靜脈主干長度超過3/4,記2分[6]。便溏亦為氣虛血瘀證常見癥狀。對大鼠便溏狀況擬定的評分標準如下：大便成形,糞質柔軟,記0分;輕度異常，糞便稀溏部分不成形,記1分;明顯異常，糞便稀溏完全不成形,記2分。總分多于7分為造模成功。大鼠分為空白對照組、模型組、中藥低量組、中劑量組、高劑量組和西藥組。

1.2.2給藥方法 滴鼻給予各中藥組大鼠我院自制克敏芪丹鼻噴劑(0.010 8、0.021 6、0.043 2 g/ml)，主要含黃芪、川芎等藥物，每側鼻孔滴注1次。西藥組滴鼻給予內舒拿鼻噴劑5 μl，每側鼻孔滴注1次，連續給藥14 d。空白組正常攝食飲水，模型組給予高脂飼料，并為正常飲食量的1/3，不限水，直至造模結束。

1.2.3標本采集 于末次給藥后24 h取全血5 ml，3 000 r/min離心15 min，置于潔凈干燥玻璃試管中密封，-20℃保存。組織標本制定：去除大鼠下頜骨上頜骨外周皮膚及周圍軟組織，沿鼻中隔軟骨和骨交界處以冠狀面切開部分鼻軟組織，鼻背正中切開，取出鼻中隔及鼻腔外側壁呼吸區黏膜組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規切片并進行HE染色。

1.2.4指標檢測 觀察大鼠有無搔鼻、噴嚏、鼻溢液等AR典型癥狀。HE染色后在顯微鏡下觀察大鼠鼻黏膜病理改變。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清IL-4、PAF含量，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數據分析，各組數據經正態檢驗和方差齊性檢驗后，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠血液流變學指標觀察 空白組和模型組各隨機取5只大鼠進行血液流變學檢測，見表1，與對照組相比，模型組大鼠低切、血漿黏度、紅細胞聚集指數升高(P<0.05)，中切及高切差異無統計學意義(P>0.05)。結合大鼠AR癥狀判定可繼續實驗，同時用藥階段仍進行游泳及OVA滴注以維持造模。

表1 大鼠血液流變學指標Tab.1 Serum rheological parameters of

2.2大鼠行為及體征觀察 各組治療前與空白對照組評分差異均有統計學意義(P<0.05)；給藥7 d后，中藥各劑量組和西藥組大鼠評分均降低，除中藥低劑量組外均與給藥前差異具有統計學意義(P<0.05)；給藥14 d后，中藥各劑量組和西藥組大鼠評分繼續降低，與給藥7 d后評分差異有統計學意義(P<0.05)。各治療組給藥7、14 d評分均有不同程度改善，與對照組差異具有統計學意義(P<0.05)，其中中藥高劑量組、西藥組改善最為顯著，與中藥低量組差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 給藥后第1、7、14天大鼠行為及體征評分分)Tab.2 Behavioral and physical signs scores of rats at 1,7 and 14 d after

2.3鼻黏膜病理學觀察 空白對照組大鼠鼻黏膜組織完整，黏膜上皮各層細胞排列較整齊，偶見脫落，固有層可見腺管和散在血管，間質無水腫變性;模型組大鼠鼻黏膜上皮細胞變性壞死，嗜酸性粒細胞浸潤，AR氣虛血瘀證中藥高量組大鼠鼻黏膜上皮部分完整，纖毛柱狀上皮排列較整齊，固有層結構較清晰，中、低劑量組固有層內可見少量炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞增生肥厚及變性、邊緣不清，低劑量組尤甚；西藥組可見少量淋巴細胞、中性粒細胞或嗜酸性粒細胞散在分布于固有層或黏膜上皮，結構基本完整。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜病理切片HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining figure of pathological sections of nasal mucosa of rats in each group(×400)

2.4大鼠血清IL-4、PAF表達比較 如表3所示，造模后模型組大鼠血清IL-4、PAF水平明顯上升，與空白組大鼠相比差異有統計學意義(P<0.01)；用藥14 d后，中藥各劑量組、西藥組大鼠血清IL-4指標水平較模型組下降，其中中藥高劑量組、西藥組與模型組差異有統計學意義(P<0.05)，與空白組差異無統計學意義(P>0.05)；各治療組間差異無統計學意義(P>0.05)。各治療組PAF水平均有所下降，但僅有中藥高劑量組PAF既與模型組有統計學意義(P<0.05)，又與空白組差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清IL-4、PAF水平Tab.3 IL-4 and PAF levels of rats of each

3 討論

IL是一組由多種細胞分泌的、結構和功能各異的可溶性蛋白，具有調節細胞生長、分化及免疫活性等作用[7]。AR是發生于鼻黏膜的Ⅰ型變態反應，是以IgE為主導、多種細胞因子和免疫細胞參與的非特異性炎癥反應[8]。IL-4主要由活化的Th2細胞分泌，是IgE的特異性誘導劑[9]。IgE與變應原結合產生以Th2細胞免疫為主導的病理改變，導致鼻黏膜血管擴張、清水樣鼻腔分泌物增多，黏膜蒼白水腫[10]。IL-4作用于膽堿能神經導致腺體分泌旺盛、清水樣鼻腔分泌物，作用于感覺神經導致鼻癢、打噴嚏等相關AR癥狀[11]。提示IL-4含量與鼻黏膜炎癥程度及機體過敏狀態相關。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)可引起血管通透性增加，滲出增多，促進炎癥物質釋放，還可誘導血小板聚集，是AR發病的另一重要炎癥介質。正常情況下，PAF在體內含量較低[12，13]。AR患者由于長期變應原刺激，不但使PAF濃度升高，還會使其活性增強[14]。

克敏芪丹鼻噴劑由黃芪、防風、川芎等組成，補益脾肺，扶正氣，固護衛表，黃芪味甘、溫，歸肺、脾經，具有補氣固表之效；川芎辛、溫，入心包經，有活血化瘀，兼行氣之能，被譽為“血中氣藥”，其合用有“補氣而不閉邪，活血而不傷正氣”之特點，共奏益氣活血通竅之功效。AR氣虛血瘀證患者鼻腔內黏膜水腫，分泌物增多，使鼻腔內組織處于持續炎癥浸潤，導致血管通透性增高，加重局部癥狀[15]。采用益氣活血鼻噴劑直接作用于上皮細胞被破壞的鼻黏膜(靶器官)，可緩解鼻內缺血缺氧癥狀，使毛細血管通透性降低，炎癥介質、IL-4減少，血液循環通暢，氣滯血瘀癥狀減輕。

相關研究表明，黃芪可改善機體局部炎癥反應，減輕致敏狀態，阻止炎癥介質釋放，降低血清IL-4含量，可能與黃芪有效成分對免疫功能的雙向調節作用有關[16]。黃芪多糖為黃芪的主要成分，可促進免疫細胞如T細胞分化成熟，保護心肌及抗氧化，進而起抗炎作用。黃芪多糖在體外還能明顯抑制 ADP 誘導的兔血小板聚集，300 mg/L時抑制作用最強，原因可能為通過抑制血小板聚集，進而降低血清PAF含量[17]。

本研究發現，克敏芪丹鼻噴劑和內舒拿均可有效且持續地緩解AR的典型癥狀。HE染色結果說明，克敏芪丹鼻噴劑對AR引起的炎癥因子釋放、水腫、血管通透性下降等癥狀均有良好的緩解作用。2種藥物均能改善AR大鼠血清IL-4水平，差異無統計學意義，對單純性AR療效大致相同。經克敏芪丹鼻噴劑治療后，PAF水平相較于模型組有所下降，更接近空白組，而西藥組則沒有這個效果。說明對PAF水平的改善克敏芪丹鼻噴劑優于內舒拿，由于其兼有益氣活血作用，對氣虛血瘀證AR的治療優于內舒拿。

由于造模周期短、強度不夠、抽取樣本量較少等原因，血液流變學指標中切、高切未表現出明顯差異，但由于用藥階段維持造模，血液流變學其他指標差異具有統計學意義，行為學及體征評分統計有顯著統計學差異，可認為造模成功，模型組PAF水平與空白組具有顯著差異也可說明這一點。

克敏芪丹鼻噴劑作為田理教授結合臨床用藥治療AR的純中藥鼻噴劑，目前對其研究及推廣還比較少。本研究通過與內舒拿鼻噴劑進行比較，發現克敏芪丹鼻噴劑對AR具有良好的療效，對氣虛血瘀證AR效果更佳。臨床證據顯示，克敏芪丹鼻噴劑治療人體氣虛血瘀證AR的療效與內舒拿療效相當，但克敏芪丹鼻噴霧劑在緩解氣虛血瘀癥狀方面優于內舒拿，推測可能與中藥作用于整個機體有關[3]。