PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質和遺傳物質及其作用機制研究進展

張建馨，王曉彤，李洋，臧怡平，于竟，杜伯濤

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院生殖中心，哈爾濱 150086)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的內分泌疾病，患病率約為10%～20%[1]，以多囊卵巢、高雄激素血癥、胰島素抵抗(IR)和稀發性排卵為主要臨床表現，易并發肥胖、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病(CVD)和子宮內膜癌等疾病。PCOS的發病機制尚不完全清楚，環境和遺傳因素被認為是PCOS發生的潛在原因。

近年來多項研究表明，外泌體存在于PCOS患者卵泡液和血液中，并可通過傳遞多種蛋白質、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等調節細胞生理功能。本文就PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質及遺傳物質等及其相關作用機制做一綜述。

一、外泌體概述

外泌體是由細胞分泌的直徑為40 nm～150 nm的細胞外囊泡[2]。外泌體在生理和病理條件下均可由幾乎所有類型的細胞產生，并通過體液(例如血液、唾液、母乳等)廣泛分布[3]。外泌體通過細胞內多囊泡的內陷形成，然后融合到質膜上，最后釋放到細胞外。它通常在生理條件下由內質網的囊泡結構通過質膜釋放以對附近的細胞發揮調節功能[4]。外泌體是細胞信號傳遞的重要媒介，可以保護信號通路不被中斷[5]。外泌體中含有細胞特異的各種蛋白質、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等，并通過體液到達遠端的組織和器官，釋放攜帶的因子，調節細胞生理功能，它們可以反映來源細胞的病理和生理狀態。

二、PCOS外泌體中相關蛋白質

目前，關于人卵泡液中外泌體的蛋白質組學分析已有一些研究，但是與PCOS發生機制相關性的報道很少。Li等[7]通過比較PCOS和健康女性卵泡液中外泌體的蛋白質組學特征，發現兩組均含有S100-A9蛋白，而PCOS患者中的S100-A9蛋白表達量更高；除此之外，富含S100-A9的外泌體可以顯著上調卵泡液中幾種促炎因子和趨化因子的表達，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等，而上述炎癥介質的過表達正反饋增強S100-A9的表達。

S100-A9屬于25個同源的低分子量細胞內鈣結合蛋白家族，主要由活化的粒細胞釋放，通過與細胞表面受體結合觸發參與炎癥反應的信號通路，并在細胞增殖、分化和遷移等過程中發揮重要作用[8]。富含S100-A9的外泌體能夠激活顆粒細胞中NF-κB信號通路，促進炎癥反應并破壞類固醇生成。研究表明，PCOS是一種炎癥狀態，可以使卵泡液和血漿中炎癥標志物水平增加，巨噬細胞/單核細胞募集增強，卵巢局部炎癥加重。而NF-κB是炎癥調控的重要轉錄因子，且在PCOS合并IR的患者中血清NF-κB明顯高于正常對照組患者[9]。CYP17是雄激素代謝途徑中的關鍵酶，CYP17的活性增強可以促進PCOS患者中雄激素的生物合成和分泌。外泌體富集的S100-A9通過NF-κB通路顯著上調CYP17 mRNA的表達，從而干擾了類固醇生成。表明外泌體中的S100-A9主要通過NF-κB途徑干擾了幾種基因的表達和激素信號傳導，這可能與PCOS的發生機制有關。

三、PCOS外泌體中相關遺傳物質

1.miRNAs：微小RNA(miRNAs)是由20～25個核苷酸組成的一種短鏈非編碼RNA(ncRNA)分子，可通過抑制翻譯或結合靶標mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)誘導轉錄產物的降解而發揮基因表達調控作用[10]。越來越多的研究表明，miRNAs可以調控細胞生長發育、凋亡、代謝、應激反應和造血分化等多種關鍵的生物學功能。此外，循環中異常表達的miRNAs 還與PCOS、子宮內膜異位癥、糖尿病等相關。然而我們對miRNAs與PCOS之間的確切關系的認識仍是初步的，miRNAs在PCOS的診斷和治療中的潛在作用還有待明確。近年來，越來越多的研究發現，PCOS患者外泌體中存在差異表達的miRNAs，而由外泌體相關miRNAs介導的細胞間信號傳遞新機制引起了廣泛關注。

1.1 miR-320：劉凱魯等[11]和Sang等[12]均發現PCOS患者外泌體中miR-320的表達水平低于對照組。miR-320可靶向調節轉錄因子E2F1和SF-1的表達，從而抑制顆粒細胞的增殖和雌激素的生成，并促進孕酮的生成[13]。也有研究表明，miR-320a/RUNX2/CYP11A1(CYP19A1)級聯反應與PCOS患者中雌激素缺乏癥有密切聯系，miR-320a的缺乏使RUNX2失調，進而會影響PCOS患者的卵丘顆粒細胞中的類固醇生成[14]。因此，檢驗患者的miR-320a/RUNX2表達比可能會提供更準確的診斷信息，并可能影響PCOS的推薦治療方案。除此之外，miR-320還與IR有關。有研究認為，miR-320負調控其靶點基因ET-1表達[15]，通過IRS-1參與調控卵泡成熟的ERK1/2信號通路，進而抑制PCOS患者的IR[16]。

1.2 miR-27a-5p：PCOS患者罹患子宮內膜癌(EC)的風險明顯增加，而位于19號染色體上的miR-27a在PCOS患者子宮內膜癌的發病中起著至關重要的作用。Che等[17]研究發現，與正常對照組相比，PCOS患者的血清外泌體中miR-27a-5p含量更高，并證實miR-27a-5p模擬物轉染EC細胞系Ishikawa和HEC-1A后，可以通過直接作用于靶向基因SMAD4促進EC細胞的遷移和侵襲。除此之外，也有研究表明，miR-27a-3p在PCOS小鼠模型卵巢中高表達，并通過下調Creb1及其下游Cyp19a1的表達，抑制雄激素向雌激素轉化，導致雄激素積累；而雄激素可誘導miR-27a-3p的表達，并通過miR-27a-3p/Creb1/Cyp19a1通路影響顆粒細胞功能，進一步加劇雌激素和雄激素的失衡[18]。

1.3 miR-483-5p：有研究發現，miR-483-5p在PCOS卵泡液外泌體中表達明顯下降[19]。而王潔等[20]發現，在PCOS血清外泌體中miR-483-5p的表達明顯上升。胰島素生長因子(IGF1)是miR-483的3p直接靶基因，miR-483-5p通過調控IGF1和PIK3R1激活PI3K/AKT從而降低IR[21]。除此之外，miR-483-5p被發現在PCOS患者的卵丘顆粒細胞中高表達并抑制MAPK3的蛋白表達，從而阻斷MAPK信號通路、調控卵丘顆粒細胞的增殖分化[22]。MAPK信號通路是胰島素信號通路之一，它可以介導有絲分裂，并在調節細胞的增殖、分化、凋亡中發揮關鍵作用。因此，外泌體中miRNA可能通過影響胰島素靶細胞的增殖和分化來促進PCOS患者胰島素抵抗的發生。此外，P38/MAPK蛋白還被發現在卵母細胞表達，外泌體可能通過調節卵母細胞成熟參與PCOS發生發展[23]。

1.4 miR-146-5p：Jiang等[24]發現miR-146a-5p在PCOS患者血清外泌體中表達明顯上升。有研究表明，miR-146a變異的女性罹患PCOS的風險更高，這可能與miR-146a的上調有關[25]。miR-146與炎癥反應和IR有關，miR-146作為先天免疫反應中的負反饋調節通路的因子，避免機體發生過度的炎癥反應；miR-146可以直接抑制TLR下游幾個促炎分子的表達，包括IL-1受體相關激酶1(IRAK1)、IL-1受體相關激酶2(IRAK2)和TNF受體相關因子6(TRAF6)等[26]。有實驗發現PCOS小鼠模型中miR-146a表達上調，且慢性低度炎癥和氧化應激可能是PCOS的主要病因[27]。有實驗驗證miR-146a的直接靶基因中約有54%與胰島素敏感性相關，并且發現miR-146a與miR-155正相關[28]。這兩種miRNA被認為可能是FoxO1基因調節劑，而FoxO1基因是胰島素信號級聯反應的關鍵下游介質[29]。因此，外泌體中的miR-146a是否通過miR-146a/FoxO1參與PCOS及IR的發生發展還需進一步探究。除此之外，FoxO1在促進PCOS的卵泡閉鎖和GCs凋亡中起著重要作用[30]。

1.5 miR-199：研究發現，卵泡液外泌體中的miR-199 在PCOS組的表達水平低于對照組[11]。然而，與之相反，也有研究顯示PCOS患者卵泡液外泌體中的miR-199表達顯著上調[19]。Shao等[31]通過雙熒光素酶基因測定，鑒定WT1為miR-199a-5p的靶基因，并且抑制miR-199a-5p可導致WT1介導的JAK/STAT3途徑的激活，表明miR-199a-5p可能通過WT1介導的JAK/STAT3通路調控PCOS的發生機制。同時，miR-199a-5p可以刺激PCOS卵巢顆粒細胞凋亡。

2.lncRNA：長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非編碼RNA，它的長度超過200個核苷酸。Karreth等[32]提出了一種稱為競爭性內源性RNA(ceRNA)的理論，即lncRNA、mRNA和假基因可以競爭性地與microRNA反應元件(MRE)結合并相互作用進而調控基因表達，這提供了一種新的基因調控機制。劉琳等[33]通過高通量測序發現PCOS患者卵泡液外泌體內存在差異表達的 lncRNA，并通過實時定量PCR(RT-qPCR)驗證發現PCOS患者卵泡液外泌體中DNMT1、DNMT2、DNMT3A和H19的表達水平顯著下降，而SGK1表達水平顯著增加。

顆粒細胞(GCs)增殖可能是PCOS發生機制之一，而它的調控途徑尚不完全清楚。最新研究發現，lnc-MAP3K13-7：1在PCOS患者的GCs中高表達，伴有DNA低甲基化、DNA甲基轉移酶1(DNMT1)表達降低和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A，p21)表達增加[34]。而依賴DNMT1的CDKN1A啟動子低甲基化促進CDKN1A轉錄，抑制GCs增殖。也有研究發現，高濃度睪酮可以下調DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達，降低PDCD4啟動子區的甲基化水平，這可能與雄激素誘導GCs凋亡的機制有關[35]。

Qin等[36]發現lncRNA H19表達水平與PCOS發病風險顯著相關，且與空腹血糖水平呈正相關。所以對于易感人群，lncRNA H19可能成為PCOS早期診斷的生物標志物。Sun等[37]通過實驗證實了lncRNA H19作為ceRNA在KGN細胞中的作用，其通過lncRNA H19/miR-19b/CTGF調節軸調節CTGF的表達，而異常表達的CTGF可以參與PCOS顆粒細胞增殖和卵巢纖維化過程，最終影響PCOS的發病機制。

3.circRNA：環狀RNA(circRNA)是一種穩定的內源性非編碼RNA，可以調節基因表達并發揮多種生物學作用。circRNA的特征是共價閉環而無5′或3′極性，特殊的共價閉環結構使其比傳統線性RNA更穩定，可長時間抵抗RNase和核酸外切酶的生物學功能。

為了研究circRNA的潛在作用，Wang等[38]以非PCOS樣本為對照，對PCOS患者卵泡液外泌體進行了測序，生物信息分析發現，有167個 circRNA表達顯著上調和245個 circRNA表達顯著下調。PCOS患者中，不同的 circRNA可能與細菌感染、慢性炎癥和氧化應激相關的通路有關。除此之外，Huang等[39]通過RNA測序比較了PCOS和對照組患者卵泡液外泌體的circRNA表達譜，發現16個circRNA顯示出表達差異，其中hsa_circ_0006877(circLDLR)由低密度脂蛋白受體(LDLR)基因轉錄加工而成，該基因參與了卵巢類固醇生成；通過cytoscape軟件預測了circLDLR-miR-1294-CYP19A1競爭性內源RNA(ceRNA)網絡，并通過熒光素酶檢測及在PCOS患者卵丘細胞中相關表達得到證實。最終證實外泌體中的circLDLR會增加受體細胞中miR-1294的表達并抑制CYP19A1的表達，并降低其雌激素的分泌，外泌體這可能與PCOS的發生機制有關。

四、總結與展望

近年來，對PCOS的研究主要基于基因改變和表觀遺傳學等傳統領域，而PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質及遺傳物質等及其相關作用機制也已引起廣泛關注。隨著從不同類型的外泌體中分離出各種蛋白質和遺傳物質，人們逐漸認識到它們在細胞信號傳遞和表觀遺傳調控中的關鍵作用。重要的是，無論是在病理狀態還是生理狀態下，外泌體的含量都受到其親代細胞的精細調節，通過將信息從親代細胞傳遞給其他細胞以實現特定功能。反過來，也可以通過分析其外泌體含量來估計親代細胞的功能狀態，這為基于外泌體的診斷奠定了基礎。因此，外泌體有望成為一種新型的標志物來評估多囊卵巢的狀況，深入研究外泌體的作用和作用機制，尤其是外泌體中各種蛋白質、miRNA、lncRNA和circRNA等，將為治療多囊卵巢提供新的策略，最終可能為其診斷、治療和預后提供重大創新。雖然外泌體顯示出潛在的重要性和意義，但外泌體應用于臨床的可能性還需要更多更有力的證據支持。