LncRNA-ZFAS1對心肌纖維化調控作用研究

焦 磊,宮熳鈺,張 瑩

(哈爾濱醫科大學藥學院藥理學教研室,黑龍江 哈爾濱 150000)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度大于200 bp、不具有編碼成熟蛋白質能力的RNA分子[1]。近年來，大量研究顯示[2-3],lncRNA參與腫瘤、糖尿病、心血管疾病等多種疾病的發生發展中。鋅脂蛋白編碼基因Znfx1(zinc finger，NFX1-type containing 1)的反義鏈即鋅脂蛋白反義鏈1(zinc finger antisense 1，lncRNA-ZFAS1)，是一種長鏈非編碼RNA。最初，lncRNA-ZFAS1被發現對乳腺癌、結直腸癌等腫瘤具有調控作用[4-5]。我們前期研究發現，lncRNA-ZFAS1對心血管系統具有調控作用。lncRNA-ZFAS1是急性心肌梗死的外周血潛在診斷標志物[6]。深入機制研究我們發現，lncRNA-ZFAS1是肌漿網鈣ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a)的內源性抑制劑，誘發心肌細胞內鈣超載，從而引起心肌梗死后心臟收縮舒張功能障礙[7]。此外，我們還揭示心肌梗死后心肌細胞中lncRNA-ZFAS1的高表達會引發心肌細胞線粒體凋亡途徑激活，從而誘發心肌細胞凋亡[8]。

心肌纖維化(cardiac fibrosis，CF)常常伴隨病理性心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等多種心血管疾病發生。心肌纖維化一旦發生難于逆轉[9-10]。目前，臨床上針對心肌纖維化的特異性治療手段相對缺乏，是該領域的瓶頸問題。因此，探索心肌纖維化發生發展的關鍵機制，發現心肌纖維化的新靶點，并針對分子水平的新靶點提出有效的防治措施，具有重要的意義。本研究通過構建在體和離體心肌纖維化模型以及過表達lncRNA-ZFAS1轉基因小鼠，探究lncRNA-ZFAS1對小鼠心肌纖維化的調控作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑阿佛丁(Avertin)購買自Sigma-Aldrich公司，貨號為T48402；lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)：sense 5′-GCGUGAACUCCUGAGGCGAdTdT-3′和antisense 5′-UCGCCUCAGGAGUUCACGCdTdT-3′購買自廣州市銳博生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)購買自Sigma公司，貨號a9525。MTT試劑購買自Sigma公司貨號為M2128-100MG，引物購買自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物序列如下表所示。TRIzol試劑購買自Invitrogen公司，貨號為15596026；逆轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit購買自TOYOBO公司，貨號為fsq-101；Power SYBR Green PCR Master Mix購買自Applied Biosystems公司，貨號為4364344。α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)抗體購買自Abcam公司，貨號為ab7817。

Forward primer (5′-3′)LReverse primer (5′-3′)ZFAS1AGCGTTTGCTTTGTTCCCCTCCCTCGATGCCCTTCTCo1a1AAGAAGACATCCCTGAAGTCATTGTGGCAGATACAGATCAAGCo3a1TTGGGATGCAGCCACCTTGCGCAAAGGACAGATCCTGAGTGFβ1GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTATTGGTTCAGCCACTGCCGTAβ-actinACTGCCGCATCCTCTTCCTTCAACGTCACACTTCATGATGGA

1.2 儀器低溫高速離心機(美國Thermo公司)；超純水系統(美國Milipore公司)；酶標儀(瑞士Tecan公司)；Nano Drop 8000分光光度計(美國Thermo Forma公司)；逆轉錄儀(美國Thermo Forma公司)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；小動物呼吸機(UGO BASILE)；Odyssey紅外熒光掃描系統(LI-COR)。

1.3 動物健康清潔級C57BL/6雄性小鼠，8周齡，體質量(25-28) g，購買自遼寧長生生物技術有限公司(NO.SCXK(遼)2020-0001)。LncRNA-ZFAS1轉基因小鼠，通過CRISPR/Cas9技術在C57BL/6小鼠染色體中條件性敲入小鼠ZFAS1基因，將穩定遺傳的ZFAS1敲入小鼠與工具小鼠(αMHC-Cre)雜交，最終獲得心臟特異性過表達lncRNA-ZFAS1的轉基因小鼠。實驗動物的使用均符合哈爾濱醫科大學動物倫理委員會規定。

1.4 方法

1.4.1建立小鼠心肌梗死(MI)模型 C57BL/6小鼠腹腔注射麻醉劑2%阿佛丁溶液(0.01 mL·g-1)后，固定，氣管插管呼吸機，連接心電圖裝置，待呼吸穩定后，打開胸腔，撕開心包膜，以7/0帶針縫合線結扎冠狀動脈左前降支，待心尖變白，心電圖(ECG)顯示ST段明顯太高，表明心肌梗死模型建立成功。假手術組(Sham)不結扎，其他操作與實驗組相同。關閉胸腔，縫合傷口，繼續飼養4周后，用于后續實驗。

1.4.2Masson染色 取心肌梗死模型小鼠心臟梗死邊緣區組織塊，Sham組小鼠、lncRNA-ZFAS1轉基因小鼠和野生型小鼠左心室心臟組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋、切片，依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min→75%乙醇5 min梯度脫水→水洗，蘇木精液染核5-10 min。用Masson麗春紅酸性復紅液5-10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化3-5 min，光綠液染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.4.3原代成纖維細胞培養 取1-3 d內新生C57BL/6乳鼠，75%的乙醇中消毒，采用斷頭法處死乳鼠后，取出心臟，剪碎心臟組織，加入胰蛋白酶消化心臟組織，用含有10%胎牛血清的高糖培養基終止消化，待所有組織塊消化完畢后，1 500 r·min-1條件下離心5 min，棄去上清，用含血清的培養液重懸細胞，細胞懸液均勻鋪到六孔板中，37 ℃孵箱中培養1.5 h后，成纖維細胞貼壁，棄掉懸液，加入適量的含血清培養液，培養成纖維細胞。

1.4.4細胞加藥與轉染 原代培養的心肌成纖維細胞貼壁后，細胞密度達70%-90%時進行加藥和轉染實驗。實驗分為對照組、加藥Ang Ⅱ組(終濃度為100 nmol·L-1)、加藥Ang Ⅱ后轉染siZFAS1(終濃度為100 nmol·L-1)組，加藥Ang Ⅱ后轉染陰性對照siNC(終濃度為100 nmol·L-1)組，加藥和轉染48-72 h后進行后續實驗。

1.4.5MTT 將加藥Ang Ⅱ組和對照組心肌成纖維細胞中加入MTT溶液(0.5 mg·L-1，20 μL)，在37℃孵箱中孵育4 h后，棄去液體，每孔加入200 μL DMSO，將96孔板平放在水平搖床上10 min，用酶標儀檢測在490 nm的吸光度值。

1.4.6實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 取心臟組織樣本或心肌成纖維細胞，以TRIzol法提取RNA，利用Nano Drop 8 000分光光度計測定RNA濃度，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit 試劑盒的方法將RNA逆轉錄成cDNA。配置SYBR Green法PCR反應體系，包括SYBR Green(10 μL)，Forward Primer(1 μL)，Reverse Primer(1 μL)，cDNA (1 μL)，Nuclease-Free Water(1 μL)。PCR反應程序為95 ℃進行10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環進行40次。采用ΔΔCt法分析Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達量。

1.4.7Western blot 取心肌組織適量，加入200 μL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，待心臟組織裂解充分后，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清液，利用BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白分子，基層膠：70 V，恒壓30 min，待Marker各條帶均分開后調電壓。分離膠：110 V，待目的條帶遷移到合適位置時停止電泳進行濕法轉膜，冰浴300 mA恒流轉膜50 min。將轉膜完成的NC膜置于5%脫脂牛奶中，水平搖床室溫封閉2 h。將封閉好的NC膜于PBS中清洗放入稀釋好的一抗中4 ℃搖床過夜。次日將完成一抗孵育的NC膜用PBST清洗3次。于室溫避光孵育熒光二抗50 min，孵育結束后NC膜用PBST避光清洗3次。利用Odessey紅外成像掃描儀在紅外熒光掃描系統下掃描觀察NC膜，通過配套軟件分析蛋白條帶光密度值。

2 結果

2.1 LncRNA-ZFAS1在心肌纖維化模型小鼠心臟組織中的表達情況小鼠心肌梗死模型建立4周后，取材心臟組織進行Masson染色，結果顯示，MI組小鼠心臟組織中膠原沉積顯著高于假手術組(Sham)，表明在體心肌纖維化模型建立成功。取心臟組織進行qRT-PCR，結果顯示，心肌纖維化模型小鼠心臟組織中lncRNA-ZFAS1的表達顯著升高(Fig 1B，P<0.05)。這表明lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化具有潛在調控作用。

Fig 1 Expression of lncRNA-ZFAS1 in cardiac tissues of mice with myocardial fibrosis

2.2 轉染敲減lncRNA-ZFAS1的siRNA對心肌纖維化的影響為進一步探究lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化的調控作用，我們構建了離體水平心肌纖維化模型。Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中，細胞增殖顯著增加(Fig 2A，P<0.01)；lncRNA-ZFAS1的表達顯著升高(Fig 2B，P<0.05)。為進一步探究lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化的影響，我們構建了敲減lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)。Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中轉染了siZFAS1后，lncRNA-ZFAS1的表達明顯降低。轉化生長因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFβ1)和Ⅲ型膠原(collagen type III alpha 1 chain，Col3a1)是表征心肌纖維化的標志性蛋白。Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中TGFβ1和Col3a1 的表達顯著升高，敲減lncRNA-ZFAS1后，可以顯著降低兩者的表達(Fig 2B，P<0.05)。以上結果表明，敲減lncRNA-ZFAS1可以抑制Ang Ⅱ誘導的心肌纖維化。

Fig 2 Effect of knock down lncRNA-ZFAS1 on myocardial fibrosis

2.3 過表達lncRNA-ZFAS1轉基因小鼠的心肌纖維化情況為進一步探討lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化的影響，我們構建了心臟特異性過表達lncRNA-ZFAS1的轉基因小鼠。如Fig 3A的Masson染色結果所示，成年lncRNA-ZFAS1轉基因小鼠(transgenic mice，TG)心臟組織中膠原沉積比野生型小鼠(wild type mice，WT)明顯增加。此外，TG組心臟組織中α-SMA的表達顯著高于WT組(Fig 3B，P<0.01)。并且與WT組相比，TG組Ⅰ型膠原(Col1a1)和Col3a1的表達顯著升高(Fig 3C，P<0.05)。這表明lncRNA-ZFAS1過表達轉基因小鼠出現了心肌纖維化。

3 討論

lncRNA-ZFAS1作為長鏈非編碼RNA家族中的一員，在細胞核和細胞質中均有表達，并且其在人和小鼠中具有約70%的保守性[7]。lncRNA-ZFAS1對多種腫瘤的發生、發展具有調控作用。Xie等[11]研究證實，lncRNA-ZFAS1通過靶向miR-484促進結直腸癌細胞增殖和侵襲。有研究表明，lncRNA-ZFAS1在胃癌組織中高表達，這種高表達是誘發胃癌細胞增殖和遷移的重要原因[12]。在膠質瘤中，lncRNA-ZFAS1可以通過激活內皮間質轉化(EMT)和Notch信號通路促進膠質瘤發展，降低晚期膠質瘤患者生存率[13]。此外，Li等[14]研究發現，lncRNA-ZFAS1通過靶向抑制miR-150，從而調控ZEB1、MMP14和MMP16的表達，進而抑制肝癌轉移。隨著研究深入，我們課題組發現lncRNA-ZFAS1不但對腫瘤具有調控作用，對心血管系統也發揮重要作用。我們研究發現lncRNA-ZFAS1具有成為心肌梗死外周血診斷標志物的潛力，對心肌細胞中SERCA2a蛋白具有抑制作用，從而誘發心肌細胞內鈣超載，引起心肌梗死后心臟功能障礙和心肌細胞凋亡[6-8]。lncRNA-ZFAS1在心肌細胞中的作用已經相對明確，但是其對心肌成纖維細胞以及心肌纖維化的調控作用尚不明確。

本研究中，我們首先構建在體心肌纖維化模型，利用Masson染色確定心肌纖維化模型構建成功，進一步檢測發現心肌纖維化組織中lncRNA-ZFAS1的表達顯著升高。提示lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化具有潛在調控作用。離體水平進一步研究發現敲減lncRNA-ZFAS1后，由Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中纖維化相關因子TGFβ1和Ⅲ型膠原表達顯著降低，這表明敲減lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化具有保護作用。有趣的是，在心肌細胞特異性過表達lncRNA-ZFAS1的轉基因小鼠的心臟組織中出現膠原沉積，并且纖維化相關蛋白α-SMA和Ⅰ型膠原以及Ⅲ型膠原的表達顯著升高。前期研究已經闡明lncRNA-ZFAS1在心肌細胞中的高表達會引發心肌細胞凋亡。有研究顯示，心肌細胞凋亡與心肌纖維化密切相關，心肌細胞凋亡會刺激心肌成纖維細胞增殖從而導致心肌纖維化[15]。這可能是lncRNA-ZFAS1轉基因小鼠心臟組織產生纖維化的原因。但是具體機制仍有待進一步研究。

Fig 3 The myocardial fibrosis in lncRNA-ZFAS1 transgenic mice

綜上，本研究發現lncRNA-ZFAS1對心肌纖維化具有調控作用，敲減lncRNA-ZFAS1具有抗心肌纖維化的效果。