二氫楊梅素經激活SIRT1-AMPK通路抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟脂質沉積

王紫涵，羅金定，呂慧婕，田英入，何劍琴，奉水東，凌宏艷

(南華大學衡陽醫學院 1.生理學教研室; 2. 2017級臨床21班; 3. 公共衛生學院，社會醫學與衛生事業管理學教研室，湖南 衡陽 421001)

隨著生活水平的提升，肥胖呈逐年上升趨勢，肥胖不僅影響人體的美感，而且給人們的健康造成極大的危害。因此，肥胖已成為世界性亟待解決的問題[1]。

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)多提取自葡萄科蛇葡萄屬的一種木質藤本植物，主要有效成分為黃酮類物質，常用于治療與炎癥和氧化應激損傷相關的疾病[2]。研究發現[3]，DHM可降低血清總膽固醇(serum total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平，增加高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)水平；研究還發現，DHM可通過調控去乙酰化酶1(sirtuin1， SIRT1)信號通路降低肝癌細胞內甘油三酯的蓄積，進一步改善肝細胞脂肪變性[4]。另有研究顯示： SIRT1可通過LKB1(liver kinase B1)依賴方式介導腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的作用[5]： AMPK可通過激活棕櫚酰基轉移酶1(carnitine palmityl transferase 1，CPT1)與過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)，抑制乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP-1)與脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)來調控脂質代謝[6-7]。綜合文獻分析，我們推測DHM可能通過激活SIRT1-AMPK通路抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟脂質蓄積。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3～4 周C57BL/6J雄鼠(60只)，體質量 (17±1.5) g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供)，合格證號為： SCXK(湘)2020-0002。飼養于南華大學動物房(3～5只每籠)，動物房內12 h明暗交替；將環境溫度設置為(23～24) ℃，并保證小鼠充足的飼料與飲用水，實驗過程以美國國立衛生研究院的《國家實驗動物健康與管理條例》為標準。

1.2 材料

1.2.1實驗藥品、試劑 Trizol試劑(G3013)及逆轉錄試劑盒(WG441-K1622)來自Servicebio公司；兔抗小鼠SREBP-1抗體(AF8055)、FAS抗體(AF6861)、ACC抗體(AF1867)、CPT1抗體(AF6558)、PPARα抗體(AF7794)、SIRT1抗體(AF5300)、AMPK抗體(AF1627)和β-actin抗體(AA128)購于Beyotime公司。

1.2.2實驗儀器 中國上海博迅實業公司的普通光學顯微鏡 (BM-139C)；美國Bio-Rad公司的熒光定量PCR儀(CFX384 Touch)；美國Bio-Rad公司的基礎電泳儀(1656001)與電泳槽/轉印槽(1703930)。

1.3 二氫楊梅素溶液的配制DHM購于張家界志誠生物科技有限公司。將雙蒸水置于70 ℃的恒溫水浴箱中加熱，20 min后，將一定量的DHM溶解在已經加熱好的雙蒸水中，并用玻璃棒攪拌均勻，配置為50 g·L-1濃度的DHM溶液。

1.4 肥胖模型的建立和分組實驗鼠分籠適應性喂養1周后進行隨機分組，采用正常飼料和高脂飼料喂養，同時分別采取或不采取低、高劑量的DHM(125 mg·kg-1·d-1和250 mg·kg-1·d-1)灌胃處理16周。因此，實驗共分成6組(n=10)： 正常對照組(ND組)、正常對照+低劑量二氫楊梅素組(ND+L-DHM組)、正常對照+高劑量二4氫楊梅素組(ND+H-DHM組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+低劑量二氫楊梅素組(HFD+L-DHM組)、高脂飲食+高劑量二氫楊梅素組(HFD+H-DHM組)。在此期間，每4周記錄1次小鼠體重。實驗結束時(16周末)，所有小鼠禁食處理后稱重，肥胖模型成功建立的標準為HFD小鼠體質量超過ND小鼠體重的百分之二十或更多。

1.5 體脂和血脂的測量16周末，將小鼠禁食過夜，然后進行稱重與眼眶靜脈取血，離心取上清液，采用生化分析儀測小鼠血脂(總膽固醇、甘油三酯與高密度脂蛋白)。由于肩胛下、附睪與腹股溝的脂肪體積大且易分離，占小鼠脂肪的大部分，可反應小鼠體脂的變化。因此將小鼠脫頸椎處死后，取肩胛下、附睪與腹股溝的脂肪并用電子秤進行稱重，并記錄脂肪重量。

1.6 肝臟蘇木精-伊紅染色取肝臟組織，切取一塊厚約5～7 mm，類似等邊三角形的肝臟組織， 4 ℃磷酸緩沖液沖洗組織后， 10%的甲醛溶液固定24 h，用自動包埋機和輪轉式石蠟切片機來包埋與切片，切片的厚度約為4 μm。最后通過自動染色機用蘇木精與伊紅對標本進行染色后封片。于顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織石蠟切片染色結果并拍片。

1.7 肝臟油紅O染色將1.6步驟中切片的肝臟組織，用4%甲醛固定0.5 h后,用 0.3% 油紅O染液染色半小時，然后經蘇木精復染0.5 min后，甘油封片，顯微鏡下觀察并拍攝。

1.8 實時定量PCR檢測肝臟組織SIRT1、AMPK、參與脂質生物合成的(SREBP1、FAS、ACC1)和參與脂質分解的(PPARα、CPT1)的mRNA表達用TRIzol提取肝組織的總RNA。測定其純度及濃度，隨后將RNA進行反轉錄并擴增。引物如Tab 1所示。Real-time PCR采用20 μL反應體系，3個步驟:(i) 雙鏈DNA在95℃下分離，(ii)引物在58℃退火半分鐘,(iii)最后72 ℃延伸半分鐘, 進行35個循環。用2-ΔΔCt計算每個基因的相對表達量。

Tab 1 Genes detected and their primers and fragment lengths

1.9 Western blot檢測肝臟組織SIRT1、AMPK、脂質生物合成有關基因(SREBP1、FAS、ACC1)和脂質分解代謝有關基因(PPARα、CPT1)的蛋白表達研磨肝臟組織、提取蛋白質，測定濃度。取30μg蛋白進行 SDS- PAGE 電泳、轉膜、封閉后加入抗SIRT1、FAS、AMPK、ACC1、PPARα、SREBP1、CPT1抗體，抗體稀釋倍數為1 ∶1 000，4 ℃搖床過夜之后洗滌。然后放入二抗，室溫反應2～4 h，充分洗滌后加入ECL化學發光試劑進行反應。曝光后進行掃描分析。

2 結果

2.1 DHM對高脂飲食誘導的肥胖小鼠體質量、體脂、血脂與肝臟脂肪蓄積的影響

2.1.1DHM可抑制高脂飲食喂養的肥胖小鼠體質量增加 如Fig 1 所示：與ND組相比，小鼠經喂食高脂飼料16周后，體質量增加，提示肥胖小鼠模型復制成功。DHM處理的HFD小鼠從第8周體質量開始降低。提示DHM處理可使肥胖小鼠體質量減少，但對正常小鼠的體質量無明顯改變。

Fig 1 Body mass of c57bl/6j mice fed with high fat diet reduced by dihydromyricetin ( n=10)

2.1.2DHM可抑制高脂飲食喂養的肥胖小鼠體脂重量增加 如Fig 2所示：相比ND組，HFD組體脂重量升高；高劑量或低劑量DHM能使HFD小鼠體脂重量下降；但與ND組相比，經DHM處理的ND小鼠體脂重量卻無明顯變化。提示DHM能夠抑制HFD小鼠體脂重量升高，但對ND小鼠體脂重量無影響。

Fig 2 Body fat weight in obese mice induced by a high fat diet reduced by dihydromyricetin n=10)

2.1.3DHM對HFD小鼠血脂的影響 如Tab 2 所示： HFD組小鼠的血清TG、TC與HDL含量明顯比ND組高；經高、低劑量處理的DHM小鼠血脂低于HFD組；但經高劑量或低劑量DHM處理的ND小鼠與ND組之間的血脂水平無明顯差異。提示DHM可降低HFD小鼠的TC、TG和HDL，但對正常小鼠無明顯影響。

Tab 2 Effects of dihydromyricetin on blood lipid of obese mice induced by high fat diet n=10)

2.1.4DHM抑制高脂飲食喂養的肥胖小鼠肝臟脂質蓄積 HE與油紅O染色結果表明(Fig 3)：ND小鼠肝小葉結構無異常，肝臟細胞分布有序、大小均一、胞質豐富，放射狀分布在中央靜脈周圍，無變性、壞死；而HFD小鼠肝臟細胞排列紊亂，肝細胞腫大，呈氣泡狀，出現彌漫性脂肪變性，細胞質中富含大小不一的圓狀脂質滴，細胞核受脂質滴影響發生變性、偏移；HFD小鼠經DHM處理后肝細胞脂滴狀況明顯改善，細胞結構恢復正常，肝臟細胞脂肪變性的面積及密度降低。但L-DHM與H-DHM對ND小鼠肝細胞形態無明顯影響。提示：DHM可降低HFD小鼠肝臟脂質蓄積。

2.2 DHM抑制HFD小鼠肝臟脂質蓄積的機制

2.2.1DHM對HFD小鼠肝臟SIRT1和AMPK 基因與蛋白表達的影響 定量PCR(Fig 4A)和Western blot(Fig 4B)結果顯示，小鼠肝組織中mRNA和蛋白的表達量：相比ND組，HFD組小鼠SIRT1和AMPK量降低；而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組小鼠SIRT1和AMPK量升高；但L-DHM與H-DHM對ND小鼠SIRT1和AMPK mRNA和蛋白表達無影響；提示DHM能夠增加HFD小鼠SIRT1和AMPK的基因及蛋白表達。

2.2.2DHM對HFD小鼠肝臟脂質合成代謝有關因子(SREBP1、ACC1和FAS)mRNA及蛋白表達的影響 qRT-PCR(Fig 5A)和Western blot(Fig 5B)結果顯示小鼠肝組織中mRNA和蛋白的表達量：相比ND組，HFD組SREBP1、ACC1與FAS表達明顯升高，而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組SREBP1、ACC1和FAS表達降低；但ND組、ND+L-DHM和ND+H-DHM 3組間SREBP1、ACC1和FAS mRNA和蛋白表達無明顯差異。提示DHM可能通過降低HFD小鼠肝臟中參與脂質生物合成的SREBP1、ACC1和FAS 的表達改善其肝臟脂肪沉積。

Fig 3 Lipid deposition in liver of obese mice induced by high fat diet reduced by dihydromyricetin

Fig 4 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of SIRT1 and AMPK in livers of obese mice induced by high fat diet n=4-5)

Fig 5 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of SREBP1, ACC1 and FAS in livers of obese mice fed with high fat diet n=4-5)

2.2.3DHM對HFD小鼠肝臟脂質分解有關因子mRNA及蛋白表達的影響 qRT-PCR(Fig 6A)和Western blot(Fig 6B)結果顯示：相比ND組，HFD組參與肝臟脂質分解的 PPARα和CPT1 mRNA和蛋白表達降低，而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM小鼠的肝臟中PPARα和CPT1 mRNA和蛋白表達升高。但ND組、ND+L-DHM和ND+H-DHM 3組間PPARα和CPT1 基因和蛋白表達無明顯差異。提示DHM可能通過增加HFD小鼠肝臟脂質分解代謝有關因子(PPARα和CPT1)的表達改善其肝臟脂肪沉積。

Fig 6 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of PPARα and CPT1 in livers of obese mice fed with high fat diet n=4-5)

3 討論

肥胖是一種由于能量攝入過多，造成體內脂肪異常聚積的疾病，是當今世界患病率增長最為迅速的代謝性疾病之一，其中將近80%的肥胖患者，都伴隨著程度不同的肝臟脂肪變性[8]。肝臟是機體代謝的重要器官，肥胖的發生發展與肝臟代謝失衡緊密相關，同時肥胖也是肝臟代謝失衡的重要原因。肥胖個體中過量的脂肪組織導致游離脂肪酸大大增加，從而使肝臟、胰腺β細胞等代謝組織內脂質含量增加，引起一些代謝性疾病。肥胖會通過增加肝細胞死亡率、增加活性氧生成、改變脂肪因子、細胞因子平衡等在肝臟形成促纖維脂增生，進而促進一系列肝臟代謝疾病發生發展[9]。雖然藥物治療是肝臟脂質沉積患者的理想選擇，但目前仍未找到可長期使用且安全有效的藥物。因此，還需要尋找新的靶點研發新的藥物，解決肝臟脂質沉積問題的道路仍然艱巨。

本課題組前期工作已經證實：DHM能使高脂飲食喂養的肥胖小鼠的體重與體脂下降，并對白色脂肪組織棕色化起正性作用[10]。也有相關文獻表明：高脂飲食是誘導肥胖、肝細胞脂肪變性、胰島素抵抗等代謝性疾病的重要因子[1]。那么，高脂飲食是否能影響肝臟脂質沉積呢？本研究結果表明：高脂飲食的小鼠體重、體脂、血清總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白增加，肝細胞腫大、呈現彌漫性脂肪變性、細胞質中富含大小不一的圓形脂質滴、肝臟細胞呈氣泡狀，肝臟內脂質生物合成有關基因的表達增加、脂質分解有關基因表達降低，提示：高脂飲食會誘導肥胖小鼠肝臟脂質沉積。

DHM是藤茶中最豐富的天然類黃酮類化合物，具有保護心臟、保護肝臟、改善糖尿病、抑制腫瘤等廣泛的藥理作用，具體機制可能是通過調節炎癥與氧化應激[11]；DHM也可降低血清總膽固醇和甘油三酯水平，并增加高脂血癥大鼠的高密度脂蛋白水平[12]，那么，DHM能否改善高脂飲食喂養的肥胖小鼠肝臟脂質沉積？本研究發現，DHM能使HFD小鼠體質量、體脂、血清總膽固醇、甘油三酯與高密度脂蛋白水平發生明顯下降，且DHM能減輕肥胖小鼠肝臟彌漫性脂肪變性、減少胞質中的圓形脂滴，提示：DHM可改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟脂質沉積，其具體機制是什么呢？

SIRT1和AMPK是兩種重要的能量傳感器。去乙酰化酶1(Sirtuin1, SIRT1)是一類蛋白脫乙酰酶，具有NAD+依賴性，是動物代謝平衡過程中的關鍵傳感器[13]。SIRT1是肝臟代謝的重要調控因子，可以在肝臟糖異生、白色脂肪組織棕色化和胰島素分泌等過程中發揮作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是以絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶形式存在的細胞能量傳感器，在維持機體代謝平衡過程中發揮關鍵作用。AMPK的激活能夠增加分解代謝并降低ACC、FAS、SREBP等脂質合成有關因子的表達水平，降低合成代謝的速率，調節脂質合成及利用[14]。SIRT1通過LKB1依賴方式介導AMPK的作用，進一步控制下游脂質調控因子[15]。SIRT1的過量表達還能增強機體的AMPK及ACC的磷酸化，進一步抑制高糖誘導的FAS升高及血脂積聚[16]。

最近研究發現，DHM能夠通過FLCN/FNIP1/AMPK途徑改善胰島素抵抗和阻止肥胖誘導的慢性肌纖維減少[17]。研究表明AMPK能夠通過激活CPT1和PPARα調控脂質分解過程。脂質轉運過程中，過氧化物酶體與內質網這兩種重要的代謝途徑可能會由于CPT1的降低而增強。脂質最初生成由ACC、FAS及SCD先后作用，產生脂酰輔酶 A，脂酰輔酶 A經過進一步的轉化形成脂肪酸，并以TG的形式存貯在肝臟中。PPARα則通過促進線粒體及許多過氧化物酶體對脂肪酸的氧化過程來調控肝臟脂質分解[18]。

本研究結果表明：DHM處理的肥胖小鼠肝臟中SIRT1、AMPK及PPARα和CPT1 的表達明顯增強，而SREBP1、FAS和ACC1則明顯減弱。提示，DHM可能通過激活SIRT1-AMPK通路，進而抑制脂質合成、促進脂質分解，達到改善高脂飲食誘導的小鼠肝臟脂肪蓄積的目的。