桃葉珊瑚苷通過激活ERβ途徑抑制心肌細胞凋亡

李春曉，張璐莎，張麗媛，馬璐璐，王倩怡，方樂玉，楊文杰，孫 偉，冷雨澤，陳 璐，王 虹

(天津中醫藥大學中西醫結合學院、方劑學教育部重點實驗室、天津市中藥藥理學重點實驗室、天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617)

抑制心肌細胞凋亡發揮抗心肌缺血損傷從而改善急性心肌梗死后心功能的作用，其部分作用機制與ERβ通路的激活有關。

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是全球死亡率最高的疾病之一[1]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)能夠導致不可逆的心肌細胞損傷或繼發的心肌供血不足。雖然現有的治療方法能夠改善冠狀動脈血流，增加缺血區域的血液供應從而達到治療效果[2]，但其發病率和死亡率依然居高不下。氧化應激損傷是缺血性心臟病的主要發病機制[3]，活性氧的積累導致心肌細胞的壞死和凋亡，其中細胞凋亡貫穿心肌梗死發生的整個病程[4]，因此減少心肌梗死后的心肌細胞凋亡對限制心肌梗死患者的組織損傷程度及改善心臟功能具有重要意義。

雌激素受體β(estrogen receptor β，ERβ)在調節正常生理、衰老和多種疾病中發揮重要作用[5]。ER最典型的功能為配體激活的轉錄因子，介導激素調節的組織和器官中的基因轉錄[6]。研究表明[7]，絕經后婦女急性心肌梗死的增加可能與體內雌激素水平下降和ERβ表達下降有關。在心肌梗死中，ERβ通過調節PI3K/AKT信號通路改善急性心肌梗死患者的心功能及MI后的心肌纖維化[8-9]，是預防及治療圍絕經期綜合征患者急性心肌梗死的潛在靶點之一。

桃葉珊瑚苷(aucubin，AU)又稱β-D-吡喃葡萄糖苷，是杜仲、車前草、地黃等中藥材的有效成分之一。近年來研究表明，AU具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等多種藥理作用[10-11]，對免疫、心腦血管、神經系統均有保護作用，但其對心肌細胞凋亡的作用機制尚不清楚。本課題組前期研究發現AU具有植物雌激素樣作用[12]，能夠激活雌激素受體。本研究旨在探討AU對心肌凋亡的影響及其機制，為AU防治缺血性心臟病提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與動物 大鼠H9c2，購于美國ATCC公司，8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物研究中心，許可證號:SCXK(京)2016-0006。

1.1.2藥物與試劑 AU購于成都曼斯特生物科技有限公司(批號：DST190907-004)，純度為99.93%，分子量為346.33，分子式：C15H22O9；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α，貨號：315-01A)購于PeProTech；放線菌酮(Cycloheximide, CHX，貨號：M4881)、MTT(貨號：M8180)購于Solaibro；MPP dihydrochloride(貨號7A/198343)、(R,R)-THC(貨號：6A/192678)購于tocris公司；DCFH-DA粉末(貨號：D6883)購于Sigma；DMEM(貨號：SH30022.01)購于Hyclone；胎牛血清(FBS，貨號：04-001-1ACS)、雙抗(青鏈霉素，貨號：03-031-1B)、胰蛋白酶(貨號：03-052-1A)購于Biological Industries；β-Actin (3E5) Rabbit mAb(貨號：4970)、caspase-3 Antibody(貨號：9662)、Akt Antibody(貨號：4691)、 p-Akt Antibody(貨號：4060)、Bcl2 Antibody(貨號：3498)、Bax Antibody(貨號：2772)購于CST；Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor?594 conjugate(貨號：A-11012)購于Invitrogen；In Situ Cell Death Detection Kit(貨號：11684817910)購于Roche。

1.2 方法

1.2.1動物及給藥 小鼠在體實驗經天津中醫藥大學倫理委員會(中國天津)批準，在體研究方法均按照指南操作。所有動物實驗均按照美國指南(NIH出版物#85-23，1985年修訂)和赫爾辛基宣言的原則進行。將小鼠飼養于溫度(22±2) ℃和濕度55%±5%房間中，12 h照明/12 h黑暗晝夜交替，在進行實驗前適應性喂養1周。研究中使用的AU為10 mg·kg-1·d-1，辛伐他汀作為陽性藥，使用劑量為10 mg·kg-1·d-1。將AU和辛伐他汀溶解在生理鹽水中灌胃給藥。

1.2.2手術 腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠，結扎左前降支冠狀動脈建立急性MI模型。手術后將小鼠隨機分為4組：假手術組，模型(生理鹽水)組，AU組和Sim組。從d 0開始，將小鼠隨機分組給藥。

1.2.3超聲心動 在術前1 d，術后7、14和28 d，用Vevo 2100TM高分辨率超聲生物顯微鏡(VisualSonics Inc.，Canada)和Vevo分析軟件(Vevo 2.2.3，[VisualSonics Inc.])進行超聲心動圖測量。麻醉小鼠后，記錄M-模式短軸圖像和B-模式長軸圖像。測量左心室收縮末期容積(LVESV)和舒張末期容積(LVEDV)。計算左心室射血分數(LVEF)(LVEF=[LVEDV-LVESV]/LVEDV)。

1.2.4Masson染色 在造模28 d超聲心動圖分析后取材，用體積分數0.04多聚甲醛固定后包埋在石蠟中，并在縫合線下方500 mm距離處切片。通過Masson's Trichrome染色評估心臟組織的梗死面積。

1.2.5細胞培養 細胞培養所用培基為DMEM加入體積分數0.1的胎牛血清，及體積分數0.01的青鏈霉素混勻，4 ℃存放。細胞于體積分數0.05的CO2、0.95空氣、37 ℃、飽和濕度的培養箱內培養。細胞融合至0.8～0.9時進行傳代。

1.2.6細胞活力檢測 正常培養細胞融合至0.8時，以8×103個細胞每孔接種于96孔板中，分別為Control(0.1%DMSO)組；model組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，0.1%DMSO)；AU 10 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 10 μmol·L-1)；AU 20 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1)；AU 50 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 50 μmol·L-1)，共5組，每組6個復孔。造模同時用AU處理心肌細胞6 h后進行MTT檢測。MTT使用濃度為0.5 g·L-1，每孔加入20 μL并在37 ℃下孵育4 h。除去含MTT的培養基后，每孔加入200 μL DMSO，用酶標儀檢測490 nm處各孔的OD值。

1.2.7IncuCyte活細胞成像系統 H9c2細胞以含體積分數0.1的FBS的DMEM完全培養基常規培養，當細胞生長覆蓋到培養皿的0.9后用胰酶消化，細胞計數后，以8×103個細胞每孔接種于96孔板中。用顯微鏡觀察細胞情況后置于培養箱中培養。將實驗分為6組，每組3個復孔，分別為分別為Control(0.1% DMSO)組；model組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，0.1%DMSO)；AU 20 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1)；E2組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，E2 10 nmol·L-1)；AU+MPP組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，MPP 100 nmol·L-1)；AU+MPP組(10 μg·mL-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，MPP 100 nmol·L-1)；AU+(R,R)-THC組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，(R,R)-THC 100 nmol·L-1)。細胞培養24 h后，細胞貼壁良好，鋪展生長，此時吸棄培養液，置換成體積分數0.01的FBS的完全培養液進行血清饑餓。血清饑餓24 h后，依據上述分組置換成含有TNF-α及CHX的的完全培養液中。造模6 h后，進行TUNEL染色，置于Incucyte中拍照。

1.2.8Western blot 正常培養細胞融合至0.8時，以2.4×105個細胞每孔接種于6孔板中，分別為Control(0.1% DMSO)組；model組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，0.1%DMSO)；AU 20 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1)；E2組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，E2 10 nmol·L-1)，共4組，每組3個復孔。培養24 h待細胞貼壁生長良好后，按分組加入培基，造模給藥6 h后提取總蛋白。用BCA法進行蛋白濃度測定，取等量蛋白進行SDS-PAGE，半干法轉膜，與相應一抗二抗結合反應后，用化學發光法檢測抗原抗體結合區帶。用凝膠成像分析儀進行電泳條帶的拍照與分析。實驗中以β-actin為內參，分別檢測了caspase-3、Bax、Bcl2、p-Akt、Akt。

1.2.9TUNEL染色 正常培養細胞融合至0.8時，以8×103個細胞每孔接種于96孔板中，將實驗分為6組，每組3個復孔，分別為分別為Control(0.1% DMSO)組；model組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，0.1%DMSO)；AU 20 μmol·L-1組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1)；E2組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，E2 10 nmol·L-1)；AU+MPP組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，MPP 100 nmol·L-1)；AU+MPP組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，MPP 100 nmol·L-1)；AU+(R,R)-THC組(10 μg·L-1TNF-α，5 mg·L-1CHX，AU 20 μmol·L-1，(R,R)-THC 100 nmol·L-1)。細胞培養24 h后，細胞貼壁良好，鋪展生長，此時吸棄培養液，24 h后置換成含有TNF-α(10 μg·L-1)、CHX(5 mg·L-1)的完全培養液6 h后使用In Situ Cell Death Detection Kit試劑盒進行染色，DAPI復染細胞核。

2 結果

2.1 AU能夠改善心肌梗死小鼠的心功能超聲心動檢測術前1 d，術后給藥7 d、14 d和28 d左心室短軸縮短率和射血分數。結果顯示，心肌梗死前組間的短軸縮短率和射血分數無顯著差異，兩者均具有正常的心肌功能。心肌梗死后，心肌梗死的C57BL/6小鼠隨機分組，在d 7、14和28進行相關指標的檢測。結果顯示，模型組、AU組及陽性藥組相較于假手術組的EF%和FS%明顯降低。給藥后7 d，AU及陽性藥組與模型組之間沒有顯著差異。但給藥后d 14、28，AU組給藥效果良好，明顯優于模型組(Fig 1A, B)。連續給藥28 d后，對來自小鼠的心臟組織進行Masson染色。結果顯示正常心室結構完整，心肌纖維化不明顯，梗死部位無藍色，無心室壁變薄。在模型組中，心室壁嚴重梗塞，纖維化，變薄和心室腔擴大，纖維化程度占整個心室壁的約40%～50%。非梗塞區域有松散的組織細胞和增加的空隙。給藥組與模型組相比，給藥組的心室壁纖維化及心室腔的變化得到改善(Fig 1C, D)。

2.2 AU能夠減少急性心肌梗死小鼠心肌細胞凋亡連續給藥28 d后，對來自小鼠的心臟組織進行TUNEL染色。心肌細胞的凋亡可以通過TUNEL+/DAPI雙色熒光重合信號確認，TUNEL+ cell為紅色，DAPI為藍色。結果顯示AU給藥組與生理鹽水組相比，TUNEL+(red)信號明顯減少(Fig 2)。

2.3 AU提高TNF-α/CHX損傷模型中的心肌細胞活力課題組前期結果表明，TNF-α/CHX能夠成功誘導心肌細胞損傷，為了確定藥物濃度，本研究采用MTT法檢測不同濃度下AU對模型中細胞活力的影響，結果顯示AU在20 μmol·L-1及50 μmol·L-1時，能夠明顯在TNF-α/CHX損傷模型中增加細胞活力，差異具有統計學意義(Fig 3)。預處理24 h能夠增強其保護作用。

2.4 AU能夠減少TNF-α/CHX損傷模型中的細胞凋亡為了進一步證明AU的抗凋亡作用，本研究采用Western blot法檢測TNF-α/CHX損傷模型中6 h時caspase-3、Bcl2、Bax、Akt以及p-Akt蛋白的表達，結果顯示造模6 h時，模型組與對照組相比，caspase-3蛋白表達增加，差異具有統計學意義；AU組與模型組相比，caspase-3蛋白表達減少，Bcl2/Bax比例上調，其結果差異具有統計學意義(Fig 4)。

2.5 AU能夠促進ERα以及ERβ的表達確定AU的抗凋亡作用后，本研究進一步對AU如何影響凋亡做了進一步的探討，采用Western blot方法檢測AU對心肌細胞中ERα以及ERβ的表達的影響，結果顯示AU能夠明顯促進心肌細胞中ERα以及ERβ的表達，差異具有統計學意義(Fig 5)。

Fig 1 AU improves cardiac function and reduces infarct size after MI

Fig 2 AU inhibits apoptosis of myocardial cells after MI

2.6 ERβ抑制劑能夠減弱AU的抗凋亡作用為了探討AU是否通過激活雌激素受體抑制細胞凋亡，本研究采用TUNEL法檢測ERα的抑制劑MPP和ERβ的抑制劑(R,R)-THC對給藥后TNF-α/CHX損傷模型中凋亡的影響。結果顯示， MPP對AU的心肌細胞保護作用無明顯影響；而加入(R,R)-THC后，細胞凋亡數量較AU組有明顯上升，其結果差異具有統計學意義(Fig 6)。本研究證明，AU能夠激活ERβ發揮心肌保護作用。

Fig 3 AU improves myocardial cell viability against TNF-α/CHX treatment

Fig 4 AU inhibits apoptosis induced by TNF-α/CHX

Fig 5 AU promotes ERα and ERβ expression

3 討論

AU是杜仲等中藥的活性成分之一，本研究發現AU可使ERβ表達升高，抑制心肌細胞凋亡，并且加入ERβ抑制劑可阻斷AU的抗凋亡作用。表明AU可以通過激活ERβ通路，發揮抗心肌缺血損傷從而改善急性心肌梗死后心功能的作用。

植物雌激素是對具有雌激素相似結構，能夠作用于雌激素受體的一類化合物的統稱。課題組前期研究證實AU是一種具有植物雌激素樣作用的小分子，能夠激活雌激素受體[12]。雌激素受體ER于發現于1958年，其中ERβ分布于卵巢、中樞神經系統、心血管系統、肺、結腸、腎臟和免疫系統中[13]。心血管系統功能異常是臨床絕經期綜合征表現的重要方面之一，Zhang等[9]研究發現，Tg-ERβ轉基因小鼠的心肌組織Ⅰ型膠原、α-SMA、TGF-β mRNA的表達水平明顯低于野生型小鼠，說明ERβ有助于抑制心肌梗死后心肌纖維化和重塑過程，提高心肌抗纖維化能力。同時，Wang也研究發現將ERβ敲除后，PI3K和Akt磷酸化水平下調，caspase-3和caspase-8的表達增加，Bcl-2蛋白表達水平降低，證明ERβ可能是通過調節PI3K/Akt信號通路改善急性心肌梗死患者的心功能[8]。

本研究采用TNF-α和CHX共同誘導心肌細胞損傷模型，探討了AU抗心肌細胞損傷作用及其與ER信號通路的相關性。TNF-α能夠與膜受體TNFR I或TNFR II結合，激活凋亡通路，同時刺激TNF抗凋亡因子(TNF apoptosis protection fraction，TAPF)的生成，而CHX能夠抑制TAPF阻斷TNF-α激活的保護途徑[14]。有研究表明TNF-α/CHX模型誘導凋亡的主要因素是由于ROS上調誘發細胞內氧化應激和凋亡[15]，課題組成功構建了TNF-α/CHX心肌細胞損傷模型，并發現了AU的抗心肌損傷作用，為了進一步探討其抗凋亡作用是否與雌激素受體相關，本研究選用MPP作為ERα的拮抗劑，(R,R)-THC作為ERβ的拮抗劑[16]，表明AU是通過干預ERβ途徑發揮抗凋亡作用。

Fig 6 ERβ inhibitor reduces antiapoptotic effect of AU

綜上所述，AU可以通過抑制心肌細胞凋亡發揮抗心肌缺血損傷從而改善急性心肌梗死后心功能的作用，其部分作用機制與激活ERβ信號通路有關。本研究為AU應用于急性心肌梗死的治療提供了實驗依據。

(致謝 本實驗完成于天津中醫藥大學中西醫結合學院、方劑學教育部重點實驗室、天津市中藥藥理學重點實驗室、天津中醫藥大學中醫藥研究院，感謝給予的幫助！)