補體旁路激活致血管平滑肌細胞增殖活化及干預研究

李 嬌，路青瑜，郭 麗，李 敏，孫黔云

( 1. 貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，2. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3. 貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002)

隨著人類生活條件的不斷改善和提高，心血管系統常見疾病的發病率日趨增高，且有年輕化的趨向，其中動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為上述疾病典型代表之一。AS是一種復雜的、慢性的炎癥性疾病，是造成心血管疾病高發病率和死亡率的主要原因[1]，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)異常增殖是促進AS病變的主要原因[2]。VSMC是附著于血管內皮細胞表面的一層細胞，作為構成血管壁組織結構、維持血管張力的主要細胞，VSMC異常增殖會誘導細胞形態、結構和相關功能的改變，是導致AS、高血壓和高脂血癥等多種心血管疾病的細胞病理學基礎[3]。多種致病因素導致的VSMC活化和功能紊亂是炎癥發展的重要環節，能誘導VSMC產生炎性細胞因子進一步加重炎性反應，在AS發生和發展的過程中起關鍵作用，因此其動態平衡在組織的穩態中十分重要。多種因素都會導致VSMC增殖活化，例如脂多糖和高氧化低密度脂蛋白等[4-5],據報道補體激活也可以引起VSMC增殖活化[6-8]。補體是免疫系統的一個重要組成部分，當其被過度激活會導致細胞的炎癥發生和組織損傷[9-11]。補體的激活主要有3條途徑，每條途徑的激活產物不盡相同，其中旁路途經在諸多疾病中都扮演重要角色。對于補體旁路途經激活產物致VSMC的影響及作用目前尚不清晰，因此，為進一步認識和了解補體旁路過度激活對VSMC的影響及其相關病理機制，本文開展了血漿補體旁路途徑激活對VSMC產生的增殖活化作用研究，從一個新的角度和視野為臨床治療AS相關疾病藥物篩選及評價提供參考依據和合適的細胞模型。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(阿根廷Natocor-Industria Biológica公司)；DMEM高糖培養基(美國Sigma公司)；海腎熒光素酶報告質粒、NF-κBp65信號通路質粒和Dual-Luciferase reporter assy system Kit(美國Promega公司)；質粒抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、Lipo6000TM脂質體轉染試劑(江蘇碧云天生物技術研究所)；血漿標準品(normal human plasma，NHP)(德國Siemens公司)，貨號為503264C；NHP 經56 ℃水浴滅活0.5 h而得滅活人血漿(inactivated normal human plasma，INHP)；眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)由本課題組分離、純化和活力單位測定；Human E-selectin、ICAM-1和VCAM-1 ELISA Kits(武漢博士德生物工程有限公司)；p-NF-κB p65、NF-κB p65、IKK和β-Actin Rabbit mAb(美國CST公司)，貨號分別為3033S、8242S、8943S和4970S；吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)(美國Sigma公司)，貨號為P8765。

1.2 儀器CLM-170B-8-NF CO2培養箱(新加坡ESCO公司)；連續波長酶標儀Gen5(美國BioTek公司)；化學發光檢測儀(美國Promega公司)；Fusion-FX蛋白免疫印跡系統(法國Vilber公司)；TS2FL倒置相差顯微鏡及成像系統(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 細胞培養人血管平滑肌細胞株(VSMC)由南華大學陳臨溪教授惠贈。VSMC的培養用含0.15比例FBS的DMEM高糖培養基，于37 ℃、含5% CO2飽和溫度培養箱中培養。

2.2 補體旁路激活物的制備臨用前，將用生理鹽水(Normalsaline，NS)稀釋的CVF(濃度為6.5×104U·L-1)等體積與NHP輕輕混勻，37 ℃恒溫水浴0.5 h制備補體旁路激活產物(CVF-activated complement，CAC)，同時以INHP替代NHP同等條件下孵育制備產物作為對照。

2.3 CAC對VSMC增殖活化的檢測

2.3.1不同量CAC對VSMC細胞增殖的影響 把對數生長期的VSMC稀釋到7.5×106個·L-1后接種于96孔細胞培養板，種板體積100 μL/孔，24 h后進行換液處理，分別加30 μL、40 μL和50 μL/孔CAC刺激VSMC，于37 ℃刺激24 h后MTT法檢測細胞活力，鏡檢觀察細胞的形態變化，同時設置滅活血漿孵育產物對照組(Control)。

2.3.2CAC對不同時間VSMC細胞活力的影響 參照“2.3.1”試驗方法，加入40 μL CAC后，MTT法分別檢測0、6、12、24 h時細胞活力和鏡檢觀察細胞形態的變化情況，同時設置滅活血漿孵育產物對照組(Control)。

2.3.3CAC對VSMC黏附分子表達的影響 細胞接種參照“2.3.1”的方法，每孔100 μL，培養24 h后進行換液處理2次，加40 μL CAC后，用不含血清的DMEM高糖培養基補齊至100 μL，分別取0、6、12、24 h 細胞培養上清，2 000 r·min-1離心10 min取上清測定相關黏附分子的含量。

2.3.4CAC對VSMC NF-κB信號通路的影響

2.3.4.1 質粒制備 質粒制備及濃度測定參照文獻[11]。

2.3.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測CAC對VSMC NF-κB p65核內轉錄活性的影響 將對數期生長的VSMC稀釋到7.5×106個·L-1濃度進行種板，每孔100 μL，接種于96孔黑色不透光細胞培養板中，培養24 h，用溫育無血清DMEM高糖培養基進行換液處理，棄上清，每孔分別加入90 μL含血清不含抗生素的DMEM高糖培養基和10 μL轉染混合液，按Lipo6000TM脂質體轉染試劑說明書過夜轉染，轉染成功后棄去上清，加入40 μL CAC 和60 μL無血清DMEM高糖培養基處理4 h后進行熒光強度的檢測(Model)，以INHP CVF孵育產物作為對照(Control)，具體檢測方法和計算公式參考文獻[11]執行。

2.3.4.3 CAC對VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的檢測 將處于對數期生長的VSMC接種于25 cm2的一次性細胞培養瓶中，接種密度為5×107個·L-1。培養24 h，待細胞鋪滿80%～85%時進行換液處理，模型組(Model)加1.2 mL CAC后，再加1.8 mL無血清DMEM培養基補齊3 mL，分別刺激3 h和24 h后，按照碧云天胞質蛋白抽提試劑盒操作提取胞質蛋白，以INHP CVF孵育產物作為對照(Control)。蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、濕轉轉膜、一抗(1 ∶1 000)過夜孵育和二抗(1 ∶1 000)孵育1 h后，經化學發光顯色成像系統進行曝光顯影檢測和量化分析。

2.4 PDTC對CAC誘導VSMC增殖活化的干預作用

2.4.1PDTC對VSMC細胞活力的影響 參照“2.3.1”方法進行VSMC細胞的種板和培養24 h后，分別加10 μL/孔PDTC預處理VSMC 2 h，PDTC終濃度分別為：1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7和1.0×10-8mol·L-1，總體積100 μL，于37 ℃刺激24 h后MTT法檢測細胞活力。

2.4.2PDTC對CAC致VSMC增殖的影響 參照“2.4.1”方法，加入PDTC(終濃度分別為：1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1)，預孵2 h后加入40 μL/孔CAC刺激24 h，MTT法檢測細胞活力。分別以NS代替PDTC，設置NHP模型組(Model)和INHP對照組(Control)。

2.4.3PDTC對VSMC黏附分子表達的影響 參照“2.3.3”實驗方法，選取各指標表達最高時間點進行PDTC(終濃度1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1)的干預檢測，預孵2 h。以NS代替PDTC，分別設置Model組和Control組。

2.4.4PDTC對VSMC NF-κB p65核轉錄活性的影響 參照“2.3.4.2”方法進行細胞種板和轉染，其中干預組分別加終濃度為1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1PDTC預處理2 h，加入CAC 在37 ℃恒溫培養箱中4 h檢測熒光強度，按照相對核內轉錄活性公式計算Ra值，以NS代替PDTC分別設置Model組和Control組。

2.4.5PDTC對CAC致VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 參照“2.3.4.3”方法進行蛋白抽提。其中干預組加1.0×10-5mol·L-1PDTC預處理2 h，換液后盡量棄去上清，加1.8 mL無血清DMEM培養基，再加入1.2 mL CAC補齊3 mL，分別刺激3 h和24 h后，抽提胞質蛋白。按照Western bolt方法通過蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、濕轉轉膜、一抗(1 ∶1 000)過夜孵育和二抗(1 ∶1 000)孵育1 h后，經化學發光顯色成像系統進行曝光顯影檢測和量化分析。

3 結果

3.1 補體激活誘導VSMC的增殖活化

3.1.1補體激活誘導對VSMC細胞的增殖作用 如Fig 1所示，CAC能夠刺激VSMC細胞增殖，形態上細胞體積變大；在量效關系上，40 μL CAC作用時間24 h時，細胞增殖達到最大，與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，且細胞狀態變化最明顯。如Fig 2所示隨著刺激時間的延長，細胞活力增加，6 h以后，模型組和對照組之間差異具有統計學意義(P<0.01)，其中24 h時，細胞形態差異最明顯。

3.1.2CAC誘導VSMC表達黏附分子的作用 如Fig 3所示，CAC能刺激VSMC細胞表達E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。其中ICAM-1、VCAM-1的最大含量作用時間為6 h，E-selectin在12 h表達最高。

3.1.3CAC誘導VSMC NF-κB p65轉錄活性上調 CAC作用于VSMC，能夠誘導NF-κB p65核內轉錄活性上調，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05，Fig 4)。

3.1.4CAC對VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 如Fig 5所示，CAC刺激VSMC后，上調p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的表達，其中IKK蛋白表達在刺激3 h和24 h與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.01)，p-NF-κB p65和NF-κB p65表達在刺激24 h與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 1 Effect of various concentrations of CAC on VSMC cell proliferation n=3)

3.2 PDTC對補體旁路激活致VSMC增殖活化的干預作用

3.2.1PDTC對CAC致VSMC增殖的影響 5個濃度的PDTC對VSMC細胞活力均有一定的影響，且隨著濃度減小，影響逐漸降低，不同濃度間，1.0×10-4mol·L-1與其他濃度PDTC相比對VSMC細胞活力影響差值較大(Fig 6A)，因此后續實驗選擇在1.0×10-5mol·L-1以下濃度范圍內選擇。Fig 6B的結果顯示，不同濃度的PDTC均能抑制補體激活物刺激引起的VSMC增殖，使其在570 nm處吸光值降低，抑制效果與模型組相比差異具有統計學意義(P<0. 05，P<0. 01)，表現出明顯的量效關系，在細胞形態上，各組間無明顯變化(Fig 7)。

Fig 2 Effect of CAC on VSMC cell proliferation in a time-dependent manner n=3)

3.2.2PDTC對CAC誘導VSMC表達黏附分子的作用 CAC能刺激VSMC細胞表達E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。當經PDTC預處理后，E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的表達均明顯下調，其中，3個濃度PDTC處理組的E-selectin和ICAM-1與模型組相比差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01，Fig 8)；VCAM-1經高中兩個濃度PDTC處理后與模型組相比差異均有統計學意義(P<0.01，Fig 8B)，且各濃度間表現出明顯的劑量關系。

Fig 3 Expression of adhesion molecules in VSMCs after

3.2.3PDTC對CAC致VSMC NF-κB p65核轉錄活性的影響 如Fig 9所示，PDTC能夠明顯下調CAC刺激VSMC導致的NF-κB p65核內轉錄活性的升高，其中濃度為1.0×10-5mol·L-1組與模型組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

Fig 4 The transcriptional activity NF-κB p65 after exposure of VSMC to CAC n=4)

3.2.4PDTC對CAC致VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 如Fig 10所示，CAC刺激VSMC后，p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK表達明顯上調，而PDTC對其表達上調具有干預作用，其中，在CAC處理24 h時，與模型組相比差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

補體是機體固有免疫系統的重要的組成部分，在AS的誘導和發展中起著重要作用[11]。當其被激活后會產生過敏性毒素C3a、C5a和攻膜復合物MAC等一系列補體活化產物，可直接激活效應細胞產生促炎因子，使機體相關細胞增殖活化，進一步誘導血管內皮細胞的損傷和平滑肌的收縮，繼而產生炎性反應和組織損傷，引起一系列相關疾病[12]，是引發炎癥的主要介導因素[13-14]。因此，補體的干預可為AS的防治提供一種新的思路。我們前期研究結果表明，CVF激活血清中補體旁路后，誘導血管內皮細胞激活，表現出相關信號通路的活化，核內轉錄活性上調和炎性分子表達變化等一系列反應[15]。這種通過CVF特異激活補體旁路獲得補體全成分產物的方式與機體病理生理條件下補體過度激活高度相似，為進一步認識補體旁路激活對VSMC的作用提供一個很好的工具。因此，本文利用CVF來特異激活血漿補體旁路，探索補體旁路激活對VSMC增殖活化的影響，為開展防治AS藥物篩選提供一個合適的細胞模型。

在本研究中，補體旁路激活物刺激VSMC后會導致細胞增殖活化、出現明顯形態學變化，引起黏附分子的表達上調，NF-κB p65磷酸化水平增加，NF-κB p65核內轉錄活性升高，NF-κB p65和IKK蛋白表達增加，NF-κB特異抑制劑PDTC對上述炎癥反應相關指標的變化均有一定的抑制作用。VSMC表達的黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin在炎癥反應中介導炎癥細胞黏附發揮著十分重要的作用，其表達升高提示VSMC活化。NF-κB是一個主要由p50和p65兩種亞基組成的蛋白二聚體，是活化的細胞中多條信號通路的匯集點，在炎癥發生和發展過程中有著至關重要的作用[16]。在脂多糖誘導大鼠VSMC炎癥發生過程中，NF-κB通過調控介質炎癥靶基因的轉錄，進而抑制VSMC的增殖和遷移，在調節細胞炎性反應和增殖活化中起著重要作用[17]。有研究報道，抑制NF-κB信號通路活化能夠取得較明顯的平滑肌保護作用[18]。本研究中，CAC刺激VSMC后NF-κB p65磷酸化水平增加、NF-κB p65核內轉錄活性升高、NF-κB p65和IKK蛋白表達明顯上調，提示當VSMC受到CAC刺激后，NF-κB信號通路被激活，調控黏附分子和p65、IKK蛋白表達上調，增加NF-κB p65轉錄活性應答增殖活化信號。因此，上述黏附分子及NF-κB核轉錄因子等相關指標表達的上調提示CAC能夠誘導VSMC增殖活化，可直接導致基于VSMC增殖活化應答的炎癥發生。本文中，采用NF-κB信號通路活化特異抑制劑PDTC能夠明確抑制這些黏附分子和相關蛋白表達，降低NF-κB p65核內轉錄活性，表明NF-κB信號通路在補體旁路激活造成VSMC增殖活化中具有重要作用。因此，基于本研究結果，PDTC通過抑制VSMC NF-κB信號通路活化強度增加和核內轉錄活性升高來下調黏附分子的轉錄調控表達，從而抑制VSMC增殖活化，揭示PDTC對補體旁路激活導致的VSMC增殖活化具有一定的干預作用，可以作為一個有效的陽性藥物。通過本研究確定合適的細胞模型條件，可以用于VSMC增殖抑制的活性物質篩選，為下一步從補體的角度去篩選和評價相關的活性物質提供一個新的細胞模型。

Fig 5 Western blot analysis of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IKK protein expressions of VSMC induced by CAC n=4)

Fig 6 Effect of PDTC on cell proliferation n=4)

Fig 7 Effect of PDTC on VSMC morphology induced by CAC(×100)

Fig 8 Effect of PDTC with different concentrations on adhesion molecule expression of VSMC induced by

Fig 9 Effect of PDTC with different concentrations on transcriptional activity of NF-κB p65 after exposure of VSMC induced by CAC n=4)

Fig 10 Effects of PDTC on protein level of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IKK n=4)

綜上，補體旁路激活可以直接導致VSMC增殖活化，上調表達黏附分子、NF-κB p65核內轉錄活性和NF-κB信號通路活化，表明補體旁路激活會影響平滑肌細胞的正常功能，產生相關的病理生理效應，提示補體旁路途經可能在AS發生發展過程中扮演了重要角色。本研究從一個新的角度和視野為AS的防治藥物篩選提供一個潛在的細胞模型。