蛇葡萄素對人宮頸癌SiHa細胞增殖、周期及凋亡的影響

方佳慧，桂 春，張 超，熊曉妹，李永華，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，占女性癌癥的第二位[1]。目前在臨床上主要通過鉑類抗癌藥物為主的化療手段來治療宮頸癌，但部分患者會產(chǎn)生鉑類藥物耐藥性及其他不良反應(yīng)，從而影響藥物治療效果[2]。蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)在大葉蛇葡萄等藥材中含量較高[3]，在湖北西部地區(qū)資源較豐富，具有降血糖、降血脂、保肝、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[4]。近年來[5]，研究表明，AMP具有多種抗腫瘤作用，如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等，但對宮頸癌方面研究尚少，作用機制不明確。課題組前期開展了大葉蛇葡萄提取物抗腫瘤活性及作用機制的初步研究，結(jié)果顯示，AMP對宮頸癌Hela細胞的增殖有較好的抑制作用。為進一步明確AMP抗宮頸癌作用及其機制，本文選取人宮頸癌SiHa細胞，從細胞增殖、周期和凋亡及其可能機制展開研究，為天然藥物治療宮頸癌提供一定的科學(xué)依據(jù)，對后期抗癌新藥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人宮頸癌SiHa細胞(批號：CL-0210)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2藥物與試劑 AMP，購自上海源葉生物公司(批號：S06J6L1，檢測純度≥98%)；MEM培養(yǎng)基，購自武漢普諾賽生命公司；MTT購自美國Amresco公司；胎牛血清(FBS)購自美國Thermo公司；胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購自美國Hyclone公司；BCA試劑盒購自美國Biosharp公司；Hoechst33258和碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自江蘇凱基生物公司(批號：KGA108)；Rh-123染液購自上海碧云天生物公司(批號：C2007)；HRP標記的山羊抗兔二抗、LC3抗體購自美國Proteintech公司；GAPDH、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Bax抗體購自美國CST公司。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(英國RS Biotech公司)；酶標儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國Proteinsimple公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 宮頸癌SiHa細胞用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2MTT檢測細胞增殖抑制 細胞以3×103個/孔接種于96孔板。實驗設(shè)AMP組、對照組和空白組。AMP組每孔加入100 μL不同濃度培養(yǎng)基稀釋液(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)，對照組含細胞和培養(yǎng)基，空白組含培養(yǎng)基，每組設(shè)置4個復(fù)孔。藥物分別干預(yù)24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑(5 g·L-1)20 μL繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO避光溶解結(jié)晶，490 nm波長下用酶標儀測量各孔吸光度(A值)，并計算細胞增殖抑制率及IC50。

細胞增殖抑制率/%=[1-(A給藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%

1.2.3Hoechst33258染色法觀察細胞形態(tài)變化 細胞以2×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，設(shè)對照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組。干預(yù)一定時間后，PBS潤洗細胞后固定(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1,500 μL)12 min，每孔加入500 μL濃度為5 mg·L-1的Hoechst33258染色液，室溫避光染色30 min后棄去染色液，PBS潤洗3遍，自然晾干后避光條件下置于熒光倒置顯微鏡下用紫外光進行觀察，并拍照記錄。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 細胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)對照組、AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組、陰性對照組(不加染料)、PI單染組及FITC單染組，干預(yù)一定時間后收集細胞，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次。加入500 μL Binding buffer重懸細胞，Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，輕輕混勻，避光室溫染色5-15 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.5PI單染法檢測細胞周期 細胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)置對照組、AMP(20、40、80 μmol·L-1)藥物組、陰性對照組(不加PI)細胞，干預(yù)一定時間后，PBS重懸離心后，加入2 mL細胞固定液(-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇)，固定12 h，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次。每管加入Triton X-100、Rnase A、PBS及 PI混合溶液1 mL，常溫染色30 min，流式細胞儀FL2通道進行細胞周期檢測。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.6羅丹明123檢測線粒體膜電位的變化 細胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)置對照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組，藥物干預(yù)24 h后收集細胞，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次，每管加2 mL濃度為1 mg·L-1Rh-123染色液，37 ℃避光染色30 min后，于1 h 內(nèi)上流式細胞儀檢測。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測凋亡及相關(guān)蛋白的表達 細胞培養(yǎng)見“1.2.3”。設(shè)置對照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)，干預(yù)一定時間后，加入裂解液裂解細胞，冷凍離心收集上清液，BCA試劑盒進行蛋白定量。上樣后凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗過夜。次日加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影并分析結(jié)果。上述實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AMP抑制SiHa細胞增殖如Fig 1所示，與對照組相比，AMP分別作用SiHa細胞24、48、72 h時后，在濃度40-320 μmol·L-1內(nèi)，隨著藥物濃度的升高抑制率逐漸增強；當(dāng)AMP濃度分別為40、80、160 μmol·L-1時，隨著作用時間的延長抑制率逐漸增強；其中AMP作用SiHa細胞24、48、72 h的IC50值分別為(46.91±2.55)μmol·L-1、(44.22±1.98)μmol·L-1、(40.33±0.54)μmol·L-1。由結(jié)果可知，與對照組相比，AMP對SiHa細胞增殖具有明顯的抑制作用(P<0.5)，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

Fig 1 Effect of AMP on proliferation of SiHa n=3)

2.2 AMP對SiHa細胞凋亡的影響

2.2.1倒置顯微鏡觀察AMP對SiHa細胞形態(tài)的影響 如Fig 2所示，對照組細胞形態(tài)完整，呈多邊形；隨著AMP濃度的增加(10、20、40、80 μmol·L-1，作用24 h)或作用時間的延長(AMP濃度為80 μmol·L-1，分別作用6、12、24、48 h)，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞間間隙增大，細胞皺縮、變圓，高濃度組細胞碎裂，說明AMP作用于SiHa細胞后，對細胞的生長形態(tài)具有顯著的影響，且形態(tài)學(xué)的變化程度與藥物濃度或作用時間呈正相關(guān)。

2.2.2Hoechst33258染色法觀察AMP對SiHa細胞凋亡的影響 在熒光倒置顯微鏡下觀察如Fig 3所示，對照組SiHa細胞形態(tài)完整、染色均勻，細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈淡藍色熒光；當(dāng)AMP作用時間為24 h，濃度依次為10、20、40、80 μmol·L-1，細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮逐漸增多，碎裂的亮藍色染色質(zhì)逐漸增多，出現(xiàn)凋亡小體；當(dāng)AMP濃度為80 μmol·L-1，作用時間分別為6、12、24、48 h，與對照組比較，細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮增多，碎裂的亮藍色染色質(zhì)增多。結(jié)果表明，AMP可誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡。

2.2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 如Fig 4所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細胞24 h后，與對照組相比，隨著AMP濃度的升高凋亡率逐漸增大(P<0.05)；當(dāng)80 μmol·L-1的AMP分別作用SiHa細胞6、12、24 h后，與對照組相比，隨著AMP作用時間的延長凋亡率逐漸增大(P<0.05)，具有時效和量效關(guān)系。結(jié)果進一步表明AMP可誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡。

2.3 AMP對SiHa細胞周期的影響如Fig 5、Tab 1所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細胞24 h時，在0-40 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，G0/G1期分布比例呈上升趨勢，S期分布比例呈下降趨勢，在40-80 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，G0/G1期分布比例下降，S期分布比例上升，細胞周期分別阻滯在S期和G2/M期；當(dāng)AMP濃度為80 μmol·L-1，隨著給藥時間的延長，細胞周期阻滯在G2/M期，并呈一定的時間依賴性(P<0.05)。結(jié)果證明AMP對SiHa細胞周期存在一定的影響。

2.4 Rh-123染色檢測線粒體膜電位變化如Fig 6所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細胞24 h后，與對照組相比，隨著AMP濃度的升高，線粒體膜電位逐漸降低(P<0.05)，具有一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明AMP對SiHa線粒體膜電位有一定影響，其誘導(dǎo)凋亡可能與線粒體途徑相關(guān)。

Fig 2 Effect of AMP on cell morphology of SiHa cells(×100)

Fig 3 Effect of AMP on nuclear morphology change of SiHa cells(×200)

Fig 4 Effect of AMP on apoptosis of SiHa n=3) *P<0.05, **P<0.01 vs control

Fig 5 Effect of AMP on cell cycle distribution of SiHa n=3)

Tab 1 Percentage of cell cycle distribution of SiHa cells treated-with 80 μmol·L-1 AMP n=3)

2.5 Western blot檢測AMP對SiHa細胞Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響如Fig 7所示，當(dāng)不同濃度AMP作用于SiHa細胞24 h后，與對照組相比，Bcl-2/Bax和Cleaved-caspase-3的表達水平逐漸上升，具有濃度依賴性；當(dāng)80 μmol·L-1AMP分別干預(yù)6、12、24 h時，Bcl-2/Bax和Cleaved-caspase-3的表達水平逐漸上升，具有時間依賴性(P<0.05)。結(jié)果表明AMP激活了凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3，上調(diào)線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調(diào)線粒體膜上促凋亡蛋白Bax表達；同時進一步表明AMP可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡。

Fig 6 Effect of AMP on mitochondrial transmembrane potential of SiHa n=3)

Fig 7 Effect of AMP on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in SiHa n=3)

3 討論

AMP是一種主要提取自葡萄科蛇葡萄屬植物的天然黃酮類單體化合物，已有研究報道其對多種癌癥具有抗腫瘤活性，如AMP可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞的凋亡[8]，AMP通過ROS的生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[9]，課題組前期研究AMP對HeLa細胞具有抗腫瘤作用[6-7]。本研究首先通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，AMP能顯著抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，采用Hoechst33258染色法、AnnexinV-FITC/PI雙染法及Western blot法從細胞形態(tài)學(xué)、凋亡率及凋亡標志蛋白方面考察，結(jié)果提示，AMP可誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡。為進一步探討AMP抗宮頸癌可能的作用機制，本實驗開展細胞周期和線粒體膜電位研究，PI單染法發(fā)現(xiàn)AMP可使細胞阻滯在S期和G2/M期。細胞周期阻滯是指細胞周期停滯在檢查點，而檢查點的改變可導(dǎo)致細胞異常增殖。細胞的復(fù)制與細胞周期相關(guān)，藥物誘導(dǎo)細胞周期中S期阻滯不能改變細胞周期狀態(tài)，絕大多數(shù)癌細胞依賴G2/M檢查點來調(diào)節(jié)細胞復(fù)制，阻滯細胞于G2/M期的藥物對細胞復(fù)制起到了抑制作用，提示G2/M期阻滯藥物可能是天然化合物治療和預(yù)防疾病的潛在候選藥物[10]。Cyclin家族蛋白為細胞周期調(diào)控蛋白，其中cyclin A和cyclin B主要調(diào)控S期或M期，cyclin D 和cyclin E參與調(diào)控G1期向S期轉(zhuǎn)變。本研究中結(jié)果顯示，隨著AMP濃度的升高，細胞周期分別阻滯于S期和G2/M期，可能與S期和G2/M期檢查點相關(guān)的Cyclin家族蛋白表達水平變化有關(guān)。課題組在后期研究中，可開展相關(guān)周期蛋白的研究，進一步確定AMP對SiHa細胞周期阻滯的作用機制。Rh-123染色法檢測顯示隨著藥物作用濃度的升高線粒體膜電位逐漸降低，結(jié)果提示AMP可誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡的作用機制可能與細胞周期及線粒體途徑相關(guān)。

線粒體途徑是由Bcl-2家族蛋白通過控制線粒體通透性來調(diào)節(jié)細胞凋亡，Bcl-2定位于線粒體外膜，為抑制凋亡標志蛋白；Bax為Bcl-2共沉淀對應(yīng)蛋白，具有促進凋亡發(fā)生的作用[11]。當(dāng)Bax/Bcl-2比值升高時，促進細胞凋亡，相反抑制細胞凋亡[12]。為進一步證實AMP可通過線粒體途徑誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡，本文檢測了與細胞凋亡相關(guān)的代表性Bcl-2/Bax的關(guān)鍵蛋白，實驗結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達水平均下調(diào)，Bax蛋白表達水平均上調(diào)，提示AMP可以通過激活線粒體途徑發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

綜上所述，AMP可抑制SiHa細胞增殖，阻滯細胞周期，可能通過抑制線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。該研究表明蛇葡萄素在宮頸癌的治療及臨床應(yīng)用存在一定的應(yīng)用前景，為進一步開發(fā)其藥用潛在價值，后續(xù)將進一步進行體內(nèi)相關(guān)研究。