吳茱萸堿通過TRIB2/AKT信號通路誘導人白血病細胞K562凋亡

牟鳳林，劉北忠,，余莉華，但文冉，李 健，熊 玲，鐘 梁，葉 嬌

(1.重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學，教育部重點實驗室，重慶 404016；2.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院，重慶 402160)

慢性粒細胞白血病(CML)是一種與造血干細胞失調(diào)相關的骨髓增生性疾病，它以9號染色體上的ABL1基因與22號染色體上的BCR基因融合為遺傳學特征，其編碼的BCR/ABL融合蛋白可持續(xù)增強酪氨酸激酶的活性，進而激活下游信號通路，導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1]。臨床統(tǒng)計顯示，每10萬人中出現(xiàn)1～2例發(fā)病患者，約占成人新確診白血病病例的15%，其發(fā)病率呈增長趨勢[2]。目前，已有不同類型的抗CML藥物應用于臨床。其中，BCR/ABL酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)作為一線臨床用藥，取得了較好的治療效果，大大延長了患者生存率，但是，該藥物具有一定的副作用。此外，CML慢性期患者易產(chǎn)生耐藥，復發(fā)以及急變等情況，使治療效果不佳[3]。因此，尋找新的治療方法和治療靶點，以提高患者的順應性和生活質(zhì)量至關重要。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是一種從吳茱萸中提取的生物堿，具有多種生物活性，如抗炎、神經(jīng)保護和抗腫瘤等作用[4-6]。有研究報道[7-10]，EVO對乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤都展現(xiàn)出潛在的抗腫瘤活性，但其對白血病細胞增殖與凋亡的影響及作用機制尚未完全闡明，仍待進一步研究。

絲氨酸/蘇氨酸激酶 AKT作為一種原癌基因，在調(diào)控細胞代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用。在腫瘤細胞中，過度激活的AKT會導致NF-κB和mTOR通路活化，使細胞產(chǎn)生抗凋亡作用[11]。假激酶Tribbles 2 (TRIB2)也是一種致癌基因，其轉(zhuǎn)錄受到Wnt/TCF所調(diào)控，能抑制FOXO蛋白活性，影響著黑色素瘤和白血病的發(fā)生及發(fā)展。有文獻報道[12]，TRIB2能與AKT形成蛋白復合物而激活AKT，最終誘導腫瘤細胞耐藥，臨床研究也顯示TRIB2的表達水平與患者的預后相關。因此，抑制AKT的激活，可明顯誘導多種腫瘤細胞凋亡的發(fā)生[13]，有研究表明，EVO可通過抑制PI3K/AKT通路誘導黑色素瘤、肝癌、胰腺癌等腫瘤細胞的凋亡[14]，但其在白血病細胞中是否可通過抑制AKT通路誘導細胞的凋亡，以及TRIB2在EVO抑制AKT信號通路中的具體作用尚不明確。因此，本研究以人白血病細胞K562細胞為模型，探究EVO抑制其增殖的TRIB2/AKT相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株細胞株：人白血病細胞K562由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院饋贈。

1.2 主要試劑與儀器主要藥品與試劑：吳茱萸堿，SC79和SKL2001購自美國Selleck公司(貨號：S2382，S786303，S832001)；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司(貨號：L2630,V90090)；胎牛血清購自烏拉圭Lonsera公司(貨號：S711-001S)；高糖培養(yǎng)基DMEM購自美國賽默飛世爾公司；蛋白濃度測定試劑盒、凝膠配制試劑盒、青鏈霉素購自中國碧云天公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購于日本DOJINDO公司；iScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Bio-Rad公司(貨號：170-8840)；一抗抗體TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2購自美國SantaCruz公司，Cleaved caspase-3(c-caspase-3)、β-actin與二抗抗體(Goat anti-rabbit、goat anti-mouse)購自Cell Signaling Technology公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技研究所(貨號：C1062L)。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成：TRIB2：上游5′-CACAGGTCTACCCCCATCAC-3′，下游5′-CCCGATACAAGAAACGCAAT-3′。主要儀器：低溫高速離心機(平凡儀器，TGL-185)；酶標儀(美國Thermo Scientific，Multiskan MK3)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad，CFX96 Optics Module)；SDS-PAGE電泳儀(美國Bio-Rad，Power Pactm Basic)；流式細胞檢測儀(美國艾森生物科學公司，NovoCyteTM)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與收集 K562細胞經(jīng)復蘇后，使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基適當混勻細胞，于含5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，并選取處于對數(shù)生長期的K562細胞進行實驗。

1.2.2藥液配制 EVO使用DMSO溶解，配制濃度為10 mmol·L-1的儲備液，-20 ℃避光分裝保存?zhèn)溆茫瑢嶒炃笆褂肈MEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度進行實驗，DMSO的使用終濃度小于0.1%。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活性 取處于對數(shù)生長期的人白血病K562細胞，以1×103個/孔的密度將細胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后重新更換完全培養(yǎng)基，加入濃度為1、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1的EVO藥液，每孔200 μL，作為實驗組。另設置兩組，分別加入等量含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基和正常完全培養(yǎng)基作為溶劑組和對照組。細胞分別培養(yǎng)24、48 h后，據(jù) CCK-8試劑盒說明書檢測各孔的吸光度(A)，最后計算細胞存活率：細胞存活率/%=(A實驗組-A溶劑組)/(A對照組-A溶劑組)×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集對數(shù)期生長的K562細胞，按5×105個/孔加入6孔培養(yǎng)板中，實驗組分別加入不同濃度的EVO藥液處理細胞或先使用SKL2001預處理細胞后，再加入濃度為16 μmol·L-1的EVO藥液，按試劑盒說明書先后加入Annexin V-FITC和PI室溫避光孵育10 min，隨即使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測細胞mRNA的表達 按照“1.2.4”項下方法接種細胞，實驗組分別加入濃度為4、8、16 μmol·L-1的EVO藥液處理細胞，對照組加入與實驗組等量的溶媒，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h。使用TRIzol試劑提取總RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應的循環(huán)條件為：94 ℃預變性3 min，進入循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后72 ℃延伸5 min。按照iQTMSYBR Green Supermix試劑說明書配制擴增產(chǎn)物，于熒光定量PCR儀中進行檢測。

1.2.6Western blot檢測細胞蛋白水平的表達 按照“1.2.4”項下方法接種細胞，實驗組分別加入濃度為4、8、16 μmol·L-1的EVO藥液處理細胞或先使用SC79(10 μmol·L-1)預處理細胞30 mine或者SKL2001(5 μmol·L-1)預處理細胞24 h后，再加入濃度為16 μmol·L-1的EVO藥液，對照組加入與實驗組等量的溶媒培養(yǎng)48 h，抽提細胞全蛋白。蛋白進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗(TRIB2、caspase-3、Cleaved caspase-3、Bcl-2、p-AKT、p-IκBα、p-NF-κB p65、AKT、IκBα、NF-κB p65、β-actin，稀釋比例均為1 ∶1 000)后4 ℃孵育過夜；TBST液洗膜3次，每次5 min，加入對應屬性的二抗(Goat Anti-Rabbit和Goat Anti-Mouse稀釋比例均為：1 ∶10 000)室溫孵育1 h，再用TBST洗膜，于成像系統(tǒng)中檢測蛋白表達情況。獨立實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 EVO對K562細胞增殖的影響如Fig 1，檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，EVO可抑制K562細胞的生長，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。隨著EVO濃度的升高及作用時間的延長，細胞的存活率降低，其作用K562細胞48 h的IC50為16 μmol·L-1。

Fig 1 Effect of EVO onproliferationof K562 cells

2.2 EVO對K562細胞凋亡的影響如Fig 2，檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，EVO可誘導K562細胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。隨著EVO濃度的增大，細胞凋亡率明顯升高，當EVO濃度為16 μmol·L-1時，細胞凋亡最為明顯(P<0.01)。

2.3 EVO對TRIB2mRNA表達的影響如Fig 3，檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，EVO可降低TRIB2 mRNA的表達，且呈現(xiàn)濃度依賴性。隨著EVO濃度的增大，TRIB2 mRNA的表達量降低，當EVO濃度為16 μmol·L-1時，TRIB2 mRNA的表達量最低(P<0.01)。

2.4 EVO對TRIB2/AKT信號通路相關蛋白表達水平的影響以不同濃度的EVO處理K562細胞48 h，提取全蛋白，利用Western blot檢測TRIB2/AKT信號通路相關蛋白的表達。如Fig 4，結(jié)果顯示，EVO可抑制TRIB2、p-AKT、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白的表達(P<0.01)；凋亡相關蛋白caspase-3以及c-caspase-3升高(P<0.01)，Bcl-2降低(P<0.01)。

Fig 2 Apoptosis of K562 cells induced by EVO

Fig 3 Expression of TRIB2 mRNA inhibited by EVO

2.5 SC79逆轉(zhuǎn)EVO誘導K562細胞凋亡和AKT 抑制我們以濃度為16 μmol·L-1EVO作用于AKT激活劑SC79預處理后的K562細胞，流式檢測細胞凋亡，Western blot檢測TRIB2/AKT信號通路相關蛋白的表達。如Fig 5A，流式結(jié)果顯示，與EVO組相比，經(jīng)SC79預處理后，EVO誘導K562細胞凋亡率降低(P<0.01)。如Fig 5B，Western blot檢測結(jié)果顯示，與只加入EVO組相比,盡管TRIB2的表達未受SC79影響,但p-AKT、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白的表達升高(P<0.01)，凋亡相關蛋白caspase-3和c-caspase-3降低(P<0.01)，Bcl-2升高(P<0.05)。

2.6 SKL2001逆轉(zhuǎn)EVO對于TRIB2/AKT信號通路的抑制作用經(jīng)Wnt激活劑SKL2001預處理24 h再用EVO誘導K562細胞48 h，如Fig 6A所示，TRIB2的表達上升， EVO對于p-AKT的的抑制作用被削弱(P<0.01)。

3 討論

慢性粒細胞白血病是惡性血液腫瘤中比較常見的一種類型，其發(fā)病是由于融合基因BCR-ABL1可持續(xù)激活酪氨酸激酶，并通過多條信號通路，如 Ras-Raf-MAPK、STAT-Bcl-XL、PI3K-AKT、NF-κB等，參與和調(diào)控白血病細胞的惡性增殖[15]。目前，為了抵抗細胞的耐藥性，第三代TKIs已可用于CML的治療，但其也會帶來更嚴重的副作用和并發(fā)癥。對于使用TKIs的絕大多數(shù)患者幾乎需要終生服藥，停藥可能會引起復發(fā)及急變，這便大大增加了患者的經(jīng)濟負擔，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量[16]。因此，開發(fā)新的治療藥物和靶點以抵抗藥物耐藥性、減弱藥物副作用和并發(fā)癥、增加患者依從性便顯得尤為重要。

Fig 4 TRIB2/AKT signaling pathway inhibited by EVO

Fig 5 EVO-induced apoptosis of K562 cells inhibited by SC79 and its ability to down-regulate related protein impaired by SC79

Fig 6 The inhibitory effect of EVO on TRIB2 / AKT signaling pathway reversed by SKL2001

最近的研究探索中，研究人員發(fā)現(xiàn)中藥的活性成分不僅可以緩解化療藥物治療白血病的不良反應，而且還能提高患者對于癌癥的抵抗能力，提高病人的生存率，減少并發(fā)癥，改善病人的生活質(zhì)量，降低復發(fā)率。吳茱萸堿從傳統(tǒng)中藥吳茱萸中提取而來，具有潛在的抗腫瘤活性。相關報道顯示，EVO可通過抑制PI3K/AKT通路誘導黑色素瘤、肝癌、胰腺癌等腫瘤細胞的凋亡，或通過激活JNK信號通路來誘導結(jié)腸癌細胞的凋亡[17]，但其是否可抑制白血病細胞增殖及其相關機制尚處于探索階段。因此，本研究著重探討EVO對白血病細胞凋亡的影響，并初步探索其潛在的分子機制。

本研究以K562為細胞模型，首先通過CCK-8法檢測EVO對細胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明EVO可抑制K562細胞的生長，并且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。當作用時間不變，EVO的使用濃度達16 μmol·L-1時，增殖抑制作用達到平衡，再結(jié)合IC50，綜合選擇高、中、低濃度分別為4、8、16 μmol·L-1的EVO處理細胞48 h來進行后續(xù)實驗。同時，流式結(jié)果顯示EVO可明顯誘導K562細胞凋亡，且呈濃度依賴性，這與CCK-8檢測細胞增殖的結(jié)果一致。

然后，本研究進一步對EVO誘導K562細胞凋亡進而抑制其增殖的機制進行了探究。相關研究表明，PI3K/AKT信號通路的異常激活廣泛存在于惡性腫瘤中，在該信號通路中，AKT的激活起著關鍵作用，其經(jīng)磷酸化激活后形成p-AKT，可進一步激活多種下游蛋白，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖與凋亡；而假激酶TRIB2可利用自身COP1結(jié)構域促進AKT磷酸化，充當PI3K網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)因子，激活癌細胞中的AKT，使細胞產(chǎn)生耐藥性，已有研究報道[18]TRIB2參與了白血病的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究采用qRT-PCR檢測EVO對TRIB2 mRNA表達的影響，結(jié)果顯示EVO可降低TRIB2 mRNA的表達，并且呈現(xiàn)濃度依賴性；進一步采用Western blot檢測TRIB2、p-AKT及其相關下游蛋白、凋亡相關蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，TRIB2、p-AKT、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白的表達降低，AKT、IκBα、NF-κB p65蛋白的表達沒有變化，凋亡相關蛋白caspase-3 與c-caspase-3升高，Bcl-2降低。根據(jù)該結(jié)果推測EVO通過降低TRIB2蛋白的表達來抑制AKT的磷酸化，進而阻止下游蛋白IκBα激活而釋放NF-κB p65，抑制NF-κB p65的磷酸化，最終導致直接調(diào)節(jié)細胞凋亡的相關蛋白變化，誘導細胞凋亡。另一方面，AKT、IκBα、NF-κB p65蛋白的表達沒有變化，提示EVO下調(diào)p-AKT是通過抑制TRIB2的表達來抑制AKT的磷酸化，而非直接抑制AKT的表達實現(xiàn)的。AKT的激活劑SC79能抑制EVO誘導K562細胞凋亡，并且其對TRIB2/AKT及其下游蛋白表達的抑制作用也被削弱。之前有報道TRIB2的轉(zhuǎn)錄受到Wnt/TCF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此我們使用了Wnt的激活劑SKL2001來激活TRIB2的表達，進一步研究TRIB2在其中扮演的角色。在經(jīng)過Wnt的激活劑SKL2001預處理后，發(fā)現(xiàn)EVO對TRIB2/AKT的抑制作用降低了，這進一步提示了EVO是通過TRIB2/AKT通路來抑制AKT的活性，從而調(diào)控凋亡相關蛋白的表達，最終誘導細胞凋亡而抑制其增殖。而Wnt/TCF信號通路在EVO誘導白血病細胞K562凋亡當中扮演的作用還需進一步研究。

綜上所述，EVO可明顯誘導白血病細胞K562凋亡并抑制其增殖，其機制可能是通過抑制TRIB2/AKT信號通路的激活來引發(fā)凋亡相關蛋白的表達，最終抑制細胞生長。本研究顯示，EVO具有潛在抗慢性粒細胞白血病的活性，可進一步開發(fā)應用于臨床。