五味子-甘草配伍的調血脂作用及對甘油三酯合成途徑的影響

王曉艷，李偉霞，張 輝，張明亮，孟祥樂，賈文匯，牛 璐，王 炎，唐進法

(河南中醫藥大學 1.第一附屬醫院中藥臨床評價技術河南省工程實驗室，河南 鄭州 450000,2.藥學院，河南 鄭州 450046)

五味子SchisandraechinensisFructus為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，習稱“北五味子”。因其具有酸、苦、甘、辛、咸等五味而得名，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內熱消渴、心悸失眠[1]。課題組前期研究發現，五味子中活性最強的聯苯環辛烯類木脂素-五味子素B(Schisandrin B，Sch B)，一次大劑量(0.1 ～ 2 g·kg-1)給藥，在一定時間內(12～96 h)與臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發病過程極為接近，且此過程可被臨床常用降血脂藥-非諾貝特所逆轉[2-4]。Sch B在人體中的最佳日劑量尚未確定，藥典規定五味子用量2～6 g，但有文獻研究建議成人五味子劑量為0.5～1.5 g，每天兩次[5]，相當于Sch B每天20～60 mg[6]。臨床上所用五味子劑量較大，遠遠超出了五味子的推薦用量，相當的Sch B的含量也超出了引起小鼠高脂血癥的最低劑量的人的等效劑量(973 mg)，致使五味子存在誘發高脂血癥和脂肪肝的潛在風險。

甘草GlycyrrhizaeRadixEtRhizoma為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，味甘、性平，可緩和諸藥之偏性，還能緩急止痛，顧護肝臟之氣血，有“解毒之王”之稱。臨床上含五味子的中藥方劑，多含甘草，如桂苓五味甘草湯含甘草半升，小青龍湯中甘草三兩，養陰益氣湯中含甘草15 g，茵陳退黃湯中甘草3 g，各方中五味子-甘草配比用量不同。上述方劑臨床應用并未發現脂代謝紊亂、誘發高脂血癥和脂肪肝現象，或與甘草的“解毒”作用密切相關。

血液中甘油三酯(triglyceride，TG)主要有內源性和外源性兩個途徑，外源性途徑是指食物中的脂肪在小腸分解為脂肪酸、甘油二酯和甘油一酯，當這些產物吸收入小腸細胞后合成TG，并和膽固醇一起形成乳糜微粒，通過淋巴系統進入血液循環[7]。而內源性途徑則是在肝臟中進行，肝臟會將糖類轉化成脂肪酸或從頭合成脂肪酸，脂肪酸繼而與甘油酯化形成TG，最后與載脂蛋白B等脂蛋白裝配形成極低密度脂蛋白，并分泌入血[8]。而固醇調控原件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activiated receptor-α，PPARα)是TG合成途徑中重要的調控因子，通過對其下游靶基因的調節，進而影響脂肪酸和TG的合成。

基于此，本實驗擬以五味子和甘草為研究對象，觀察大劑量五味子對正常小鼠血脂的影響，同時觀察配伍甘草后的血脂變化，以期為五味子臨床合理應用提供數據支撐。并針對TG的合成途徑進一步探討其調脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器Neofuge 1600R型低溫臺式高速離心機(上海力申科學儀器有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾科技公司)；ECLIPSE 80i型顯微鏡(日本尼康)；Rm-2235型石蠟切片機(德國萊卡公司)；TL-820型冰凍切片機(湖北泰維科技實業有限公司)；EG1150H型包埋機(德國萊卡公司)。

1.2 試劑TG(批號20190615)、總膽固醇(total cholesterol，TC，批號20190615)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C，批號20190316)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C，批號20190318)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT，批號20190320)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS，批號0911E19)、乙酰輔酶A羧化酶(acctyl-COA carboxylase，ACC，批號0911E19)、乙酰基輔酶A氧化酶(acy-CoA oxidase，ACO，批號0911E19)、甘油三磷酸酰基轉移酶(Glycerol triphosphate acyltransferase，GPAT，批號0911E19)ELISA試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；SREBP-1c(貨號ab28481)抗體購自abcam公司；PPARα(貨號GB11163)購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 藥物與其制備五味子(批號19060102，鄭州瑞龍制藥股份有限公司)；甘草(批號19080101，鄭州瑞龍制藥股份有限公司)；稱取五味子及五味子-甘草不同配比(1 ∶1、1 ∶1.5)混合藥材適量，粉碎，用5倍量80%乙醇浸泡0.5 h后，回流提取兩次，第一次回流1.5 h，第二次回流2 h。提取物過濾得濾液，合并濾液，用旋轉蒸發儀回旋至無醇味后濃縮，得五味子醇提物及五味子-甘草不同配比浸膏。其中，五味子組浸膏生藥含量為1.43 g·g-1，五味子-甘草(1 ∶1)和五味子-甘草(1 ∶1.5)浸膏中五味子生藥含量分別為0.465和0.428 g·g-1。

1.4 動物分組與給藥ICR小鼠，♂，體質量(22.47±0.68)g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2016-0006。本實驗通過河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準(批準號YFYDW2019006)。ICR小鼠分為4組，分別為:正常對照組(Control)、五味子組(SchisandraechinensisFructus，SF)和五味子-甘草配伍2個配比組(SchisandraechinensisFructus-GlycyrrhizaeRadixEtRhizoma，SG，1 ∶1，1 ∶1.5)，每組10只。五味子-甘草配伍比例依據桂苓五味甘草湯(1 ∶1)及養陰益氣湯(約1 ∶1.5)。給藥組均按照五味子藥典規定臨床等效劑量的5倍量(3.9 g·kg-1)進行灌胃給藥。對照組小鼠灌胃給予等體積的生理鹽水，每日灌胃給藥1次，連續10 d共給藥10次。

1.5 生化法檢測血脂變化末次給藥8 h后，小鼠經眼眶取血，置于EP管中，室溫靜置2 h后，3 500 r·min-1離心10 min(4 ℃)，取血清，-80 ℃分裝凍存。嚴格按照試劑盒說明書，檢測小鼠血清TG、TC、HDL、LDL含量。

1.6 生化法檢測肝功能變化取出分裝凍存的血清至室溫，嚴格按照試劑盒說明書，利用酶標儀檢測血清中ALT活性。

1.7 肝臟病理學檢查取血后立即取出肝臟，取同一部位的肝臟組織塊約0.5 cm3，迅速投入10%的中性福爾馬林中充分固定。固定48 h以上的小鼠肝臟組織，制備常規肝臟病理學切片，HE染色后，觀察其病理學變化。

1.8 酶聯免疫吸附法檢測肝臟FAS、ACC酶活性和GPAT、ACO水平各組肝臟組織，用生理鹽水經組織勻漿機研磨成組織勻漿，4 ℃，4 000 r·min-1離心15 min后，取上清液，采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書，利用酶標儀對肝臟FAS、ACC活性和GPAT、ACO水平進行檢測。

1.9 免疫組化法檢測肝臟受體SREBP-1c、PPARα蛋白表達采用免疫組化法檢測肝臟組織中SREBP-1c、PPARα蛋白的表達。切片脫蠟至水，PBS沖洗3×5 min。檸檬酸抗原修復5～10 min，自然冷卻。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫20 min。PBS浸泡5 min，3次。滴加一抗(1 ∶100)50 μL/片，4 ℃過夜。PBS浸泡5 min，3次。滴加HRP標記二抗50 μL/片，37 ℃孵育30 min，PBS浸泡5 min，3次。DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水中止。蘇木精復染，梯度酒精(80%-95%Ⅰ-95%Ⅱ-100%Ⅰ-100%Ⅱ)脫水，二甲苯(I和II)透明，中性樹膠進行封片，置于光學顯微鏡下進行觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件分析平均吸光度值。

1.10 統計學方法采用SPSS 20軟件對數據進行統計分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 血脂變化與Control相比，SF組小鼠血清TG和TC水平明顯升高(P<0.05)，血清HDL水平明顯降低(P<0.05)。與SF相比，SG 1 ∶1可明顯降低血清TG水平(P<0.05)。見Tab 1。

2.2 肝功能變化與Control組比，SF組小鼠血清ALT活性明顯升高，但無統計學意義(P>0.05)。與SF組相比，SG 1 ∶1.5可明顯降低血清ALT活性(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Activity of serum n=10)

2.3 肝臟組織病理學變化在光鏡下，對照組可見細胞形態規則，肝小葉結構正常，細胞質均勻，肝細胞自中央靜脈為中心，呈放射狀排列，伸向肝小葉周邊部，肝血竇竇間隙清晰；五味子組肝小葉輪廓不清晰，中央靜脈周圍肝細胞條索少見，肝細胞內出現較多的脂肪空泡，散布在整個胞質中，小葉內有少量炎性細胞浸潤；五味子-甘草 1 ∶1組部分肝細胞結構異常，中央靜脈周圍肝細胞索少見，部分細胞內可見較大的脂肪空泡；五味子-甘草 1 ∶1.5組肝細胞條索依稀可見，有部分細胞內存在少量的脂肪空泡。見Fig 2A-D。

2.4 肝臟組織FAS、ACC活性和GPAT、ACO水平變化與Control組比，SF組小鼠ACC活性和GPAT水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；SG 1 ∶1和SG 1 ∶1.5組小鼠GPAT水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；SG 1 ∶1和SG 1 ∶1.5組小鼠ACO水平明顯降低(P<0.01)。與SF相比，SG 1 ∶1組GPAT和ACO水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見Tab 2。

Fig 2 Histopathological changes of liver (×200)(n=4)

2.5 肝臟組織SREBP-1c、PPARα蛋白表達變化SREBP-1c蛋白陽性表達為棕褐色。SF小鼠SREBP-1c顏色較深，圖像分析結果表明，蛋白表達量較對照組明顯上調(P<0.01)。SG 1 ∶1和1 ∶1.5組棕褐色較五味子組淺，圖像分析結果表明，SREBP-1c蛋白表達量較SF組明顯下調(P<0.05，P<0.01)。見Fig 3。

PPARα蛋白陽性表達為棕褐色。結果可見，Control組小鼠PPARα蛋白表達量較多，SF組小鼠較對照組陽性表達減少，圖像分析結果表明，PPARα蛋白表達明顯降低(P<0.01)，SG 1 ∶1和1 ∶1.5組陽性染色較五味子組增多，圖像分析結果表明PPARα蛋白表達較SF組明顯增多(P<0.05，P<0.01)。見Fig 4。

3 討論

現代研究表明五味子在中樞系統、心血管系統、腎臟和生殖系統等方面應用廣泛，具有保護肝臟、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂和抗炎等作用[9]，并有研究表明五味子具有“適應原”樣作用[10]，在中樞系統具有“雙向調節”作用。而作為五味子中含量最高的聯苯環辛烯類木脂素，Sch B(50～200 mg·kg-1)小劑量可降低高膽固醇血癥小鼠肝臟TC和TG的含量，一次大劑量給藥能時間和劑量依賴性的升高小鼠血TG含量，并伴隨肝TG含量升高[2-3]，存在“雙向調節”作用。前期研究發現，低劑量五味子醇提物可降低高膽固醇血癥小鼠血清和肝臟TG含量[11]，本實驗發現高劑量的五味子可升高正常小鼠血TG和TC含量，說明五味子在調節血脂方面存在“雙向調節”作用。

Tab 1 Influence of Schisandrae Fructus and compatible with Glycyrrhiza on levels of serum TG, TC, HDL and LDL in normal n=10)

Tab 2 Influence of Schisandrae Fructus and compatible with Glycyrrhiza on activities of liver ACC and FAS and GPAT, ACO levels in normal n=10)

Fig 3 Expression of liver tissue SREBP-1c protein detected by

中藥劑量是指臨床應用時的分量，它主要指明了每味藥的成人一日量。其次指方劑中每味藥之間的比較分量，也即相對劑量。準確地掌握用藥劑量是確保用藥安全、有效的重要因素之一。由于諸多原因，中藥飲片超劑量應用現象越來越普遍，由此直接導致了我國中藥資源的大量浪費，并且有研究報道超劑量使用與不良反應的發生存在一定的關聯性，進而導致中藥飲片的不良反應發生率日益增多。中藥的配伍應用是中醫用藥的主要形式，其作用是綜合性的表現，并非指所有組成藥物的功效和劑量的簡單組合，通過配伍可提高藥效、降低毒副作用、適應復雜病情、擴大治療范圍并預防藥物性中毒。本實驗結果顯示，與五味子組比，五味子-甘草1 ∶1組血清TG含量明顯降低，表明甘草與五味子配伍可明顯降低大劑量五味子誘發高甘油三酯血癥的風險。

Fig 4 Expression of liver tissue PPARα protein detected

HDL和LDL是體內運載磷脂和膽固醇最重要的蛋白。HDL具有逆向運輸膽固醇功能，即將肝外組織中過多的膽固醇從外周組織轉運到肝臟進行代謝，通過膽汁酸或者直接通過膽汁從腸道排出，以防膽固醇在這些組織中過多地聚集，因此被認為是好的脂蛋白[12]。LDL由VLDL轉變而來，能將肝臟中的TC轉移到外周組織(如血管壁)，易造成動脈粥樣硬化，從而增加了冠心病的危險性，通常被稱為壞的脂蛋白[13]。本實驗結果顯示，大劑量五味子可明顯降低血清HDL水平，可能為其升高血清TC含量的機制之一。

SREBP-1c和PPARα在TG合成途徑中發揮重要作用[14]。肝臟中SREBP-1c作為負責調解脂肪酸和甘油三酯的重要調控蛋白，主要通過調節其下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的靶基因，包括ACC、FAS、GPAT等的表達來調節肝臟中TG的合成。ACC作為脂肪酸合成的限速酶，與脂肪合成速率密切相關；而FAS是內源性脂肪酸合成的關鍵酶，在機體脂質沉積過程中發揮重要作用[15]。GPAT是TG合成的關鍵限速酶之一，研究報道[16]，敲除GPAT基因可以減少小鼠肝臟TG沉積并改善肝臟胰島素抵抗。本實驗結果顯示，五味子組小鼠表現為肝臟SREBP-1c蛋白表達量、ACC活性和GPAT水平明顯升高，說明五味子增加肝臟中TG合成的機制可能是通過增強肝臟SREBP-1c蛋白的表達，并上調肝臟ACC活性及GPAT含量。與五味子比，五味子-甘草 1 ∶1組GPAT水平明顯降低，說明甘草配伍五味子降低五味子升高的TG含量可能與調節GPAT有關。

PPARα作為一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核轉錄因子，主要通過影響脂蛋白及長鏈脂肪酸的代謝，進而調控脂質代謝，研究表明，PPARα激活后，可直接增加脂肪酸的氧化，減少脂肪的積聚，維持內環境的穩定[17]，同時可上調其下游基因ACO的表達，從而降低TG的合成水平。ACO作為脂肪酸β-氧化反應的關鍵酶之一，可催化肝臟細胞內脂滴的氧化分解過程[18]。實驗結果發現，五味子組小鼠肝臟PPARα蛋白表達量明顯降低，ACO水平有降低趨勢，五味子-甘草 1 ∶1和1 ∶1.5組PPARα蛋白表達量較五味子組明顯升高，表明甘草通過上調PPARα蛋白的表達，從而加速脂肪酸的β氧化分解，最終可減少高劑量五味子誘發的TG合成增加。

綜上表明，高劑量的五味子一方面增加TG的合成速度，其機制可能是增加肝臟中SREBP-1c的蛋白表達，上調脂肪酸合成過程的限速酶ACC活性和TG合成過程中關鍵酶GPAT含量；另一方面，降低脂肪酸的β氧化，增加TG在肝臟中的沉積，其機制可能為下調肝臟PPARα蛋白的表達，降低脂肪酸β-氧化途徑的關鍵酶ACO的活性。通過以上兩種途徑聯合增加肝臟中TG的合成，誘發高脂血癥，而甘草配伍五味子后可通過調節TG合成途徑相關蛋白，降低五味子誘發的高脂血癥風險。由此說明，臨床應用五味子時需對其用藥劑量慎重考慮，建議配伍同等劑量的甘草，避免其在血脂方面的“雙向調節”作用，為五味子的臨床合理應用提供數據支撐。

(致謝:本實驗在河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥臨床評價技術河南省工程實驗室、中藥藥代動力學實驗室開展，感謝各位老師和同學的幫助。)