實時熒光定量PCR技術在細菌布魯氏菌檢驗中的應用效果

謝曉丹

（江門市新會區第二人民醫院，廣東 江門 529100）

0 引言

布魯氏菌是起源上世紀的人畜共患病癥，布魯氏菌通常具有羊、牛、豬、犬、綿羊以及沙林鼠等6個種類，其中牛、羊、豬、犬是主要的人畜共患菌種[1]。該病癥會促使患者產生生殖器官炎癥，造成不孕不育等病癥，并且病菌的影響具有隱匿性，通常情況下無法迅速探知細菌的存在[2]。另外，該細菌無有效的藥物進行清除，僅通過控制為主。因此早期的診斷對護理措施的開展有重要作用，檢測通常可分為血清檢測和分子生物監測，本次通過選用PCR技術，即分子生物學檢測，為探究實時熒光定量PCR技術在細菌布魯氏菌檢驗中的應用效果，選取疑似帶有細菌布魯氏菌患者進行研究，有以下報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過選取我院2019年1月至2020年1月的200例疑似帶有細菌布魯氏菌患者進行研究，通過采用實時熒光定量PCR技術減小檢測，經過病理檢測可知受檢測患者包含86例布魯氏菌患者，17例沙門菌患者，32例金色葡萄球菌患者，43例副溶血性孤菌患者以及22例輪狀病毒患者。

1.2 檢測方法

相關儀器及試劑：采用定量PCR擴增儀和其他離心機以及細菌基因組提取試劑盒。

方法：常規PCR測試方法，選用50μl，10×buffer5μl，同時引物各取0.25μl，Taq聚合酶0.8μl，dNTPs0.5μl，粗體DNA模板1μl。擴增條件：設定溫度為94℃，對樣本變性4min，隨后以94℃變性45s后降低至58℃變性40s，后延伸至72℃變性60s，共計需要經32次循環過程，最后以72℃保溫5min[3]。

實時熒光定量PCR檢測：①樣本提取：首先采用熱裂解法提取10mL的細菌培養液置于試管，隨后通過使用蒸餾水對其進行滅菌洗滌，共2次，最后選用1mL的蒸餾水懸浮，隔水煮沸10min，同時以8000r/min的離心操作進行10min離心，取上清制成DNA模板溶液。②PCR反應，于定量擴增儀進行擴增檢測，根據說明書對參數進行設定，同時需要對陽性梯度模板和陰性對照。

1.3 觀察指標

觀察實時熒光定量PCR檢測在各個細菌中的特異性和靈敏度。特異性根據PCR試劑盒以及引起病癥的細菌類型進行分析，共計5類病菌；靈敏度以定量對照模板進行10倍系列稀釋，選取一項濃度檢測結果體現在2×102～2×107/mL的范圍之間，并體現其靈敏度[5]。

觀察PCR常規檢測法與實時熒光定量PCR檢測的陽性率差別。

1.4 統計學方法

應用統計學軟件SPSS 18.0對資料進行分析處理，患者的計量資料（±s）與計數資料（%），分別應用t、χ2檢驗，以P＜0.05為差異，有統計學意義。

2 結果

2.1 各細菌攜帶者的特異性和靈敏度情況

實時熒光定量PCR檢測在各個細菌中的特異性和靈敏度分別為，特異性：布魯氏菌100.00%，沙門菌48.64%，金色葡萄球菌72.17%，副溶血性孤菌55.63%，輪狀病毒31.69%。靈敏度布魯氏菌99.9%，沙門菌42.56%，金色葡萄球菌61.52%，副溶血性孤菌51.91%，輪狀病毒26.48%，詳情見表1。

表1 各細菌攜帶者的特異性和靈敏度情況[n（%）]

2.2 PCR常規檢測法與實時熒光定量PCR檢測的陽性率對比

實時熒光定量PCR技術的陽性率為43.00%（86/200），高于常規PCR檢測法的30.50%（61/200）。

表2 PCR常規檢測法與實時熒光定量PCR檢測的陽性率對比[n（%）]

3 討論

我國屬于布魯氏菌的高發國家，在青海、西藏等地區具有極高的患病率，由于無有效的藥物進行治療，因此對病癥的預防具有重要作用。國際醫學學者在布魯氏菌的研究中提供了多項診斷操作，主要包含了以下兩大內容：①病原學檢測，病原體的分離培養是醫學目前診斷病癥的黃金標準。也是最有效的細菌檢測方式，但由于時間長、危險性高，同時需要培養活菌，操作人員具有感染的風險，因此無法廣泛用于檢測。②血清學檢測，該內容主要包含平板凝聚試驗、補體結合試驗以及酶聯免疫吸附試驗。但由于血清學檢測特異性不足，敏感度較差以及操作復雜等缺點，未能被廣泛推廣。目前有更多的分子生物學方法進行布魯氏菌是檢測，其中則包含了PCR的應用，該方式特異性以及敏感度高，可作用于布魯氏菌的定型試驗[6-8]。

本文通過選取200例攜帶細菌患者進行研究得出結果：在實時熒光定量PCR技術，顯示檢測帶有布魯氏菌患者86例，特異性100%，靈敏度為99.9%，均高于其他細菌檢測；對比各項常規PCR技術的細菌檢測，實時熒光定量PCR技術的陽性率為43.00%（86/200），高于常規PCR檢測法的30.50%（61/200），由此可見布魯氏菌在熒光定量PCR的特異性和靈敏度，同時在與常規PCR檢測對比中可保持較高的陽性率，具有較高的診斷價值[8-10]。

綜上所述，運用實時熒光定量PCR檢測細菌布魯氏菌，具有高特異性、高靈敏度以及高陽性率，診斷價值較高。