應用Het-1A細胞系研究CDDO-Me對食管黏膜上皮屏障的保護作用

程凌雪，范永強，侯超，李文波

胃食管反流病（gastroesophaeal reflux disease，GERD）是消化系統常見的慢性疾病，嚴重影響患者的心理和生活質量。我國GERD發病率呈逐年上升趨勢［1］。目前GERD的治療以質子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）抑酸為主，但有高達30%的患者對PPI治療反應欠佳［2］，尋求新的GERD防治策略很有必要。食管黏膜上皮屏障功能損害是GERD的重要發病機制［3］。當屏障功能受損時，細胞通透性增加并出現細胞間隙增寬，胃十二指腸內容物逆行彌散進入上皮層，損害食管黏膜，從而產生GERD的臨床癥狀。研究發現，核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）可調控食管黏膜上皮屏障功能，敲除小鼠Nrf2會降低其食管黏膜上皮的跨上皮電阻抗（transepithelial electrical impedance，TEER）和增加食管黏膜上皮的細胞間隙，故而小鼠出現食管黏膜上皮屏障功能下降［4］。2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9-二烯-28-酸甲酯（2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-oic acid，CDDO-Me）是一種合成的齊墩果烷三萜類化合物，是有效的Nrf2激活劑，并可增強抗氧化反應［5］。CDDO-Me是否可通過激活Nrf2途徑增強食管黏膜上皮的屏障功能，目前尚少見相關報道。本研究以Het-1A細胞系建立食管黏膜上皮屏障模型，觀察CDDO-Me對食管黏膜屏障的保護效應，探討CDDO-Me作為黏膜屏障增強劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要實驗儀器及試劑Het-1A細胞（永生化人食管鱗狀上皮細胞）購自美國組織培養庫（ATCC）。倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；低速離心機購自德國Eppendorf公司；細胞電阻儀Millicell ERS-2購自美國Millipore公司；共培養小室、細胞培養皿、細胞培養瓶購自美國Corning公司；培養基BEBM、BEGM Single Quots購自瑞士LonzA公司；血清、L-15、Trypsin-EDTA購自美國Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購自美國EQUITECH-BIO公司；CDDOMe、纖連蛋白（fibronectin）、牛Ⅰ型膠原蛋白（bovine collagen typeⅠ）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Het-1A細胞培養Het-1A細胞接種到包被好的培養方瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。細胞的密度達到80%時進行傳代，加入1 mL Trypsin-EDTA溶液（含0.5%聚乙烯吡咯烷酮，PVP）消化細胞，顯微鏡下觀察，消化5～10 min，可看到細胞相互分離變圓，即消化完成；加入3 mL含0.1% FBS的L-15終止消化，用BEBM培養基懸浮細胞，按1∶3的比例接入包被好的方瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下擴大培養。

1.2.2 酸處理細胞共培養小室包被，過夜后PBS潤洗2遍；提前1 d使用3%的鹽酸調整培養基pH分別為4、5、6；取處于對數生長期，生長狀態良好的Het-1A細胞，加入胰蛋白酶Trypsin-EDTA（含0.5%PVP）消化細胞成細胞懸液，血球計數板計數，調整細胞密度為2.5×105個/mL，在共培養小室上室加入1 mL細胞懸液，下室加入1 mL無細胞的培養基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養；待共培養小室上室細胞長滿后，按照實驗分組，即pH4組、pH5組、pH6組、對照組，分別用pH為4、5、6的培養基及正常培養基對細胞進行處理，37℃、5%CO2飽和濕度條件下分別培養5、10、30、60 min后上下室培養基全更換為正常培養基（包括對照組），每組3個復孔，每孔選3個位點檢測各小室的電阻，同時設空白組；記錄每次檢測的電阻值。

1.2.3 CDDO-Me處理細胞待共培養小室上室細胞長滿后，按CDDO-Me濃度分組對細胞進行處理，即用含0、0.25、0.5、1、2.5、5μmol/L CDDO-Me的培養基培養，培養時間為6、12、24、48 h，37℃、5%CO2飽和濕度條件下分別培養相應的時間后，再以酸處理細胞篩選出TEER較對照組變化最大的pH值及處理時間繼續培養，即pH為4的培養基培養60 min，每組3個復孔，每孔選3個位點檢測各小室的電阻，同時設空白組；記錄每次檢測的電阻值。

1.2.4 細胞TEER計算根據檢測所得的電阻值，依次計算各復孔電阻值的平均值（R總），根據公式計算每個組Het-1A細胞的TEER：TEER（Ω·cm2）=（R總-R空白）×膜面積，有效膜面積0.6 cm2。分析各組細胞TEER變化情況。

1.3 統計學方法使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。所有實驗數據以均數±標準差（±s）表示。多個時間點阻抗變量統計分析采用重復測量設計的方差分析，分析某一因素時多組樣本均數比較采用單因素方差分析，其中組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Het-1A細胞生長情況倒置顯微鏡下觀察，Het-1A細胞生長狀態良好，形態飽滿，排列緊密，可作為實驗細胞模型，見圖1。

Fig.1 Light microscope observation of the cell growth(×100)圖1 光鏡觀察細胞的生長情況（×100）

2.2 不同酸度和作用時間對食管上皮細胞TEER的影響重復測量設計的方差分析結果示，球形檢驗結果滿足球形分布假設（P＞0.05），不同處理時間（F=100.695）、不同pH處理因素（F=55.532）、pH和處理時間的交互作用（F=12.672）對TEER值的影響有統計學意義（均P＜0.01），因此，分析pH和作用時間的單獨效應。

對照組中，不同處理時間TEER比較差異無統計學意義（P＞0.05）。pH為4、5、6時，不同處理時間對Het-1A細胞的TEER作用比較差異均有統計學意義（P＜0.01），隨著處理時間（10、30、60 min）的延長，TEER下降幅度越大。處理時間為5 min時，各組TEER比較差異無統計學意義（P＞0.05）；處理時間為10、30、60 min時，各組間差異均有統計學意義，以pH4組60 min時TEER下降最明顯，見表1。

Tab.1 Changes of cell TEER values at different time points between different pH treatment groups表1 各pH處理組間不同時點細胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

Tab.1 Changes of cell TEER values at different time points between different pH treatment groups表1 各pH處理組間不同時點細胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與pH4組比較，A與同組30 min時比較，P＜0.05

組別對照組pH4組pH5組pH6組F 5 min 62.53±2.27 57.33±4.00 59.93±1.92 62.53±1.63 2.701 10 min 62.27±3.07 49.53±0.90a 54.80±2.50ab 57.67±2.72 14.286＊＊30 min 64.27±1.40 40.87±3.35a 49.27±3.97ab 53.00±2.11a 33.869＊＊60 min 61.20±3.14 29.93±2.89aA 41.13±2.02abA 46.47±2.76aA 67.667＊＊F 0.732 45.681＊＊26.078＊＊25.480＊＊

2.3 不同濃度及作用時間的CDDO-Me預刺激對食管上皮細胞TEER的影響球形檢驗結果滿足球形分布假設（P＞0.05），不同處理時間（F=50.045）、不同CDDO-Me濃度（F=32.357）、CDDO-Me濃度和處理時間的交互作用（F=7.907）對TEER值的影響有統計學意義（均P＜0.01），因此，分析CDDO-Me濃度和處理時間的單獨效應。

處理時間6 h時，不同濃度CDDO-Me預刺激組TEER比較差異無統計學意義（P＞0.05）。12、24、48 h時，不同濃度CDDO-Me預刺激組TEER比較差異均有統計學意義（P＜0.05），24 h時，隨著刺激濃度的增加，各組TEER逐漸升高，以5μmol/L組最明顯（P＜0.05）。CDDO-Me預刺激濃度為0.25μmol/L時，各時點TEER比較差異無統計學意義（P＞0.05）；濃度為0.5、1、2.5、5μmol/L時，各時點間差異均有統計學意義（P＜0.05）；濃度為2.5μmol/L時，24 h、48 h TEER值均較前一時點升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Changes of cell TEER values at different time points between different CDDO-Me pre-stimulated concentrations表2 各CDDO-Me預刺激濃度間不同時點細胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

Tab.2 Changes of cell TEER values at different time points between different CDDO-Me pre-stimulated concentrations表2 各CDDO-Me預刺激濃度間不同時點細胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與0.5μmol/L組比較，c與1μmol/L比較，d與2.5μmol/L組比較，A與同組6 h比較，B與同組12 h比較，C與同組24 h比較，P＜0.05

組別對照組0.25μmol/L組0.5μmol/L組1μmol/L組2.5μmol/L組5μmol/L組F 6 h 25.60±3.67 27.53±3.91 24.13±5.12 22.47±3.26 26.20±4.39 30.20±4.30 1.260 12 h 23.67±2.32 25.53±3.86 29.27±3.36 28.07±4.97 32.73±4.37a 35.27±4.57a 3.540＊24 h 23.80±3.56 26.40±2.23 31.00±1.31aA 37.87±3.41abA 43.73±3.93acAB 50.20±2.65abcdA 35.701＊＊48 h 23.47±1.85 27.00±2.91 34.00±2.46aA 42.47±4.39aA 51.60±2.43aABC 49.87±2.57aA 50.284＊＊F 0.335 0.203 4.539＊15.016＊＊25.711＊＊23.549＊＊

3 討論

食管上皮屏障包括結構屏障和功能屏障兩類［6］。結構屏障包括角質層上皮細胞的管腔側細胞膜和上皮細胞間連接復合物。功能屏障包括細胞內和細胞間緩沖體系、細胞膜上的離子轉運系統。食管上皮作為屏障，將有害的酸性反流物限制在食管腔內，并將其與食管傷害感受器分開［7］。食管上皮是非角化的復層鱗狀上皮，提供滲透性屏障。在食管上皮細胞之間存在緊密的細胞間連接，以維持食管上皮屏障的完整性并限制細胞旁離子擴散［8］。

反流刺激物（如反流的胃酸）最初通過攻擊細胞間連接復合物而導致食管上皮損傷，從而導致跨膜屏障功能降低以及細胞通透性增加［9］。研究表明，反流物刺激食管黏膜產生氧化應激或炎癥反應，造成食管上皮屏障功能障礙［10］。反流物可通過直接或間接作用損傷食管黏膜上皮屏障，其中胃酸是主要損傷因素［11］。研究證實，當食管黏膜屏障受損時，離子通透性增加，TEER降低［12］。因此，本研究通過測量細胞TEER來評估食管黏膜上皮屏障功能的完整性。

本研究發現弱酸損傷食管上皮屏障功能，以pH4組60 min時TEER下降最明顯，提示酸度越強，接觸時間越長，食管上皮功能損傷越重。Farre等［13］研究發現，食管黏膜暴露于酸性和弱酸性溶液，出現細胞間隙擴張，進而損傷食管黏膜完整性，與本實驗結果類似。

Nrf2是細胞內重要的轉錄因子，其參與的信號通路是細胞內重要的抗氧化應激機制［14］。在正常生理條件下，Nrf2與其生理抑制劑Kelch樣ECH相關蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結合［15］。Keap1通過蛋白-蛋白酶體途徑介導Nrf2的降解。當活性氧過表達或親電性物質刺激時，Keap1失活，導致Nrf2從蛋白酶體途徑中釋放出來并轉移到細胞核中，隨后Nrf2與小的Maf蛋白形成異二聚體，并與靶基因的抗氧化反應元件（ARE）結合，發揮抗氧化應激作用，防止細胞凋亡［16］。

抗氧化反應中的Keap1-Nrf2軸發揮關鍵作用，而CDDO-Me具有影響Keap1構象變化的能力，從而降低其催化Nrf2進行降解的能力，上調Nrf2，發揮抗氧化作用，因此該軸可作為CDDO-Me在疾病治療中使用的基礎模型［17］。作為一種無細胞毒性和多功能的藥物，CDDO-Me已在臨床試驗中應用于氧化應激相關的疾病如慢性腎病和癌癥的治療［18-19］。本研究發現，CDDO-Me對于酸對食管黏膜上皮屏障的損害有保護作用，其保護效應與CDDO-Me的濃度及作用時間有關。CDDO-Me用于胃食管反流病治療具有潛力，但其療效和安全性需更多動物實驗及臨床試驗驗證。

綜上所述，酸損害食管上皮屏障功能，與酸度和作用時間有關；CDDO-Me可干預酸損害食管上皮屏障功能，對食管黏膜上皮屏障具有保護作用。本研究為探索CDDO-Me作為藥物治療胃食管反流病奠定了基礎。