中晚期結直腸癌外周血循環腫瘤細胞檢測的臨床意義

胡招兵，賈志紅，王仁杰，吳穎虹，祝淇瀅

景德鎮市第二人民醫院1腫瘤科，2病理科，江西 景德鎮 333000

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，確診時多屬中晚期，導致治療效果和預后不佳。目前臨床常用的檢查手段有影像學檢查、腫瘤標志物、腸鏡、病理活檢等，然而受限于射線損害、有創性或特異度不高且僅能發現肉眼可見的復發、轉移，不能及時發現血液中的微小轉移灶等因素，導致對于更早期的病變無效。因此，如何有效監測腫瘤進展并準確判斷預后一直是結直腸癌研究領域的熱點。為了解決這些缺陷，以便更全面評估預后以及改善患者生活質量，需要找到更加敏感、有效的預測指標。液體活檢技術應運而生，主要包含循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體（exosome）、微小RNA（microRNA，miRNA）等技術應用于血液、漿膜腔積液等檢測[1]。伴隨分子生物技術的飛速發展，促使CTC的高效檢測成為可能。本研究探討中晚期結直腸癌外周血CTC計數變化，以期為該類患者的治療及預后評估提供重要的參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年6月景德鎮市第二人民醫院經病理證實為結直腸癌患者的病歷資料。納入標準：病理確診為結直腸癌；臨床分期為Ⅱ～Ⅳ期；美國東部腫瘤協助組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分≤2分；生存時間＞4周；首次采集CTC時患者未行任何治療。排除標準：未明確診斷或合并其他類型的惡性腫瘤；有嚴重心肺疾病、自身免疫性疾病、血液病、長期口服抗凝藥或合并嚴重感染無法接受抗腫瘤治療；臨床資料信息不完整。根據納入、排除標準，共納入結直腸癌患者36例，其中男性21例，女性15例；年齡 45～89歲，平均（69.83±8.16）歲；臨床分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期18例，Ⅳ期8例。選取同期收治的22例腸道良性病變患者為對照，其中男13例，女 9例；年齡 38～86歲，平均（61.72±7.09）歲；慢性炎癥12例，潰瘍性結腸炎3例，炎性息肉4例，克羅恩病3例。結直腸癌患者和腸道良性病變患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 化療方法 結直腸癌患者接受常規化療奧沙利鉑+卡培他濱（XELOX）方案，第1天予以130 mg/m2奧沙利鉑靜脈滴注，第1～14天1000 mg/m2卡培他濱片口服，每3周重復一次。化療第2周期結束后進行CTC檢測。

1.2.2 CTC檢測方法 取肘正中靜脈血4 ml于ACD抗凝劑真空采血管，采血后立即輕柔顛倒混勻防止出現溶血或血塊。將血全部移至50 ml離心管中，滴入工作液CS1至45 ml離心（1900 r/min，5min），棄上清滴CS2至45ml于垂直混勻儀（20r/min，8～10 min）。吸取 150 μl磁微粒混懸液至 2 ml EP管中，置于磁力架上1 min后棄上清，滴加1 ml CS1重復洗滌3次，用CS1重懸磁微粒定容100 μl。50 ml離心管中滴加3 ml CS3，將加入磁微粒中的所有液體輕輕疊加到CS3頂層，離心（1400 r/min，5 min）。輕柔吸取最上2層溶液于15 ml離心管中，滴CS1至14 ml，混勻離心（2300 r/min，室溫，5 min），棄上清，滴1 ml CS1，吹打細胞沉淀，置于磁力架上2～3 min，離心（3400 r/min，3 min），棄上清至 100 μl，加入100 μl CF1固定液，吹打混勻≥10次，涂片，取1×CF2固定液200～300 μl完全覆蓋標本區域，室溫8 min后吸去CF2，核酸雜交漂洗液中靜置10 min，梯度酒精脫水各2 min，晾干待用。避光吸取10 μl 8號/7號染色體著絲粒探針（centromeric probe，CEP），封住蓋玻片邊緣。原位雜交儀變性（76℃5 min）、雜交（37℃1.5 h），清洗，滴加 200 μl抗體，孵育（37℃ 1 h），10 μl 4，6-二脒基苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染，鏡下觀察或置于2～8℃避光保存。

1.3 CTC判讀標準

①單個細胞，核質均勻，未發現分層；②信號3個，且在胞核上；③紅色通道下CD45不顯色；④細胞表面無磁珠。經過鑒定符合上述標準的細胞，可認為是上皮組織來源的腫瘤細胞，即CTC。本研究將滿足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP7+/CD45-/DAPI+的細胞視為陽性細胞，CEP8/CEP7陽性≥2時，判讀為CTC陽性[2]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC陽性率的比較

結直腸癌患者CTC陽性率為63.89%（23/36），高于腸道良性病變患者的0%（0/22），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征的結直腸癌患者CTC陽性率的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的結直腸癌患者的CTC陽性率分別高于TNM分期為Ⅱ期、無淋巴結轉移的結直腸癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別及是否遠處轉移結直腸癌患者的CTC陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的結直腸癌患者CTC陽性率的比較（ n=36）

2.3 化療前后CTC陽性率的比較

化療后結直腸癌患者CTC陽性率為22.22%（8/36），明顯低于化療前的63.89%（23/36），差異有統計學意義（χ2=13.251，P＜0.01）。

3 討論

惡性腫瘤已然成為嚴重威脅人類健康的主要公共衛生問題之一，其中結直腸癌躍升為世界第三大惡性腫瘤[3]。中國結直腸癌發病率居惡性腫瘤第三位，病死率居第五位[4-5]，并呈逐年上升趨勢。伴隨手術、放化療等綜合手段的應用，結直腸癌患者5年和10年生存率達到65%與58%，但仍有半數左右的患者在腫瘤進展過程中出現復發、轉移、死亡[6]。

CTC指由原發或轉移灶進入血液循環系統后大多數被消滅，只有極少數以單個細胞或細胞簇形式存活的腫瘤細胞，并導致腫瘤復發轉移。健康人血液中也存在極少量的CTC（≤1個），而在腫瘤尤其伴有轉移患者中其表達水平顯著升高[7-8]。2010年美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）首次把CTC納入腫瘤TNM分期系統后[9]，有研究證實CTC數量與淋巴結轉移密切相關，陽性患者CTC數量明顯多于陰性患者[10]。目前CTC已在肺癌[11]、頭頸部惡性腫瘤[12]、食管癌[13]、胃癌[114]等腫瘤的診治過程中獲得較高的臨床價值。本研究中腸道良性病變患者均未檢出CTC，說明本次研究采用的陰性富集聯合免疫熒光原位雜交技術（immunofluorescence-fluorescence in situ hybridization，im-FISH）檢測方法的特異度較高。結直腸癌患者CTC陽性率為63.89%，這與Wang等[18]和茍苗苗等[19]的研究結果趨于一致。本研究發現CTC陽性主要集中在TNM分期中的Ⅲ～Ⅳ期患者，占76.92%，淋巴結轉移患者占76.00%，且分期越高、CTC計數有升高趨勢，說明CTC有助于評估腫瘤患者的TNM分期及淋巴結轉移，進而評價預后。

2018年AJCC將CTC納入乳腺癌的預后評估，認為乳腺癌患者外周血中存在CTC提示預后不良[15]。同期一項關于早期乳腺癌患者的大樣本、多中心臨床試驗研究表明化療后CTC的存在是總生存期和無進展生存期的獨立預測指標，且CTC計數越多，危險度越高，預后越差[16-17]。本研究發現化療后CTC陰性結直腸癌患者28例，提示這部分患者在化療過程中，CTC被化療藥物在一定程度上有效清除，說明化療方案有效果。李柔等[20]動態監測卵巢癌化療前后CTC水平發現，依據CTC計數評價療效與實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）之間的吻合度較高，且CTC表達水平與化療療效呈負相關，本研究結果也有相似的趨勢。因此，有理由相信CTC檢測可作為評估結直腸癌療效的有效指標，動態監測其變化可評價療效及預后，實現真正的個體化治療，提高患者生存獲益。對于CTC尚未轉陰的患者是否繼續治療除與患者的經濟狀況、身體耐受情況等因素有關外，是否把CTC陽性作為繼續治療的依據尚存在一定爭議，還需要大樣本研究進一步證實。不過有學者認為CTC持續陽性是接受化療的晚期結直腸癌患者無進展生存期和總生存率的獨立危險因素[21]。

近年來，靶向治療、免疫治療已然成為腫瘤治療的熱點。CTC作為術后腫瘤標本的唯一來源，不僅能完整表達腫瘤組織的生物學特性，且樣本容易獲取。伴隨對CTC基因表型的分析，體外細胞耐藥實驗以及對腫瘤的耐藥/治療靶點的不斷深入研究，CTC作為靶向治療位點將變為可能[22]。由于本研究時間較短、樣本量偏少，對于CTC與臨床療效、預后等信息的關聯性還有待下一步的研究。