微管相關蛋白4對肺腺癌 A549細胞遷移、侵襲、增殖和凋亡的影響

高標，馬凡尼，李相磊

1開封市中心醫院醫學檢驗科，河南 開封 475000

2河南大學淮河醫院檢驗科，河南 開封 475007

微管相關蛋白4（microtubule-associated protein 4，MAP4）可表達于除神經外的全身組織，其主要作用是調節細胞周期和穩定微管[1]。研究表明，MAP4可影響食管鱗狀細胞癌細胞的侵襲能力，進而影響患者預后[2]。另有研究表明，MAP4與膀胱癌細胞的遷移和侵襲有關[3]。肺腺癌是一種非小細胞肺癌，常發生于女性及不抽煙者中[4]。大部分肺腺癌起源于支氣管黏膜上皮，少數起源于大支氣管黏液腺[5]。在所有類型的肺癌中，肺腺癌的發病率較低，發病年齡相對較小，早期肺腺癌無明顯的臨床癥狀，腫瘤生長較為緩慢[6]。肺腺癌的侵襲和遷移是一個涉及多個基因的復雜過程，目前肺腺癌發生發展的分子機制尚未完全研究清楚。本研究探討了MAP4對肺腺癌細胞遷移、侵襲、增殖、凋亡的影響，旨在為研究肺腺癌發生發展的分子機制提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年8月至2020年8月開封市中心醫院收治的肺腺癌患者。納入標準：①經病理檢查確診為肺腺癌；②初診患者；③術前未接受放化療。排除標準：病歷資料不完整。依據納入和排除標準，本研究納入66例患者。其中，男51例，女15例；年齡24～80歲；有吸煙史48例；中高分化45例，低分化21例；有淋巴結轉移39例。收集肺腺癌患者的肺腺癌組織標本66例和癌旁組織標本57例。

1.2 細胞、試劑與儀器

人肺腺癌細胞株A549購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM、胎牛血清培養基均購自美國Hyclone公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶細胞消化液均購自美國Gibco公司，細胞凍存液、脂質體3000試劑盒均購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白定量試劑盒、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、HRP標記的羊抗兔IgG、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、蛋白提取試劑盒、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒均購自上海睿安生物科技有限公司，MAP4抗體購自英國Abcam公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。CO2培養箱、臺式低溫高速離心機、酶標儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，倒置顯微鏡購自德國Leica公司，顯微成像系統購自日本Nikon公司，UV2000分光光度計購自美國UNICO公司，凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 免疫組織化學染色法檢測MAP 4蛋白的表達情況及結果判定

將固定好的組織標本脫蠟至水，于抗原修復液中浸泡10 min煮沸，自然冷卻后采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，滴加3%過氧化氫溶液孵育10 min，PBS沖洗3次，血清封閉10 min，棄血清，一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，鏡下觀察。細胞質被染為棕黃色或棕褐色視為陽性。采用半定量法進行評分，陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項評分相加，0～3分為陰性，其余為陽性。

1.4 細胞培養及轉染

采用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養基培養A549細胞，于37℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3天傳代1次，待細胞生長密度超過80%時，采用胰蛋白酶消化，離心棄上清，采用細胞凍存液重懸，轉至無菌管中，保存于-80℃。向細胞中分別轉染siRNA-NC質粒和siRNA-MAP4質粒作為siNC組和siMAP4組，操作步驟依據脂質體3000試劑盒說明書進行。

1.5 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測MAP 4蛋白表達

依據蛋白提取試劑盒說明書提取細胞中的蛋白質，采用BCA法測定蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后轉膜，于室溫下采用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，采用MAP4一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，采用HRP標記的二抗于室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，采用ECL試劑盒進行化學發光顯影，按照說明書進行操作，采用凝膠成像系統采集圖像，采用BandScan 4.0軟件分析條帶灰度。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

將細胞接種于6孔板，培養24 h形成單層細胞，采用無菌槍頭進行均勻的“一”字劃痕，洗去漂浮細胞，更換培養基，繼續培養細胞，于顯微鏡下觀察24 h和48 h的細胞遷移情況。

1.7 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

采用無血清培養基將細胞饑餓培養6 h，將Matrigel膠按1∶4的比例稀釋，在Transwell上室中加入40 μl，均勻覆蓋，孵育2 h，消化后離心收集細胞，調整細胞密度至 5×105/ml，將 200 μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室中加入500 μl培養基，培養24～48 h，采用棉簽擦去小室上層的基質膠及內層細胞，將小室取出后，倒置風干，采用95%乙醇固定5 min，向24孔板中加入500 μl的1%結晶紫溶液，置入小室，浸膜于其中，室溫放置5 min后取出，PBS清洗后置于載玻片上，封片，顯微鏡下計數。

1.8 CCK- 8法檢測細胞的增殖能力

將轉染后的A549細胞培養至對數生長期，收集細胞并計數，調節細胞密度至2×104/ml，吸取100 μl細胞懸液至96孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混合均勻后，37℃孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘 化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法檢測細胞凋亡情況，收集轉染后的A549細胞進行重懸，將細胞密度調整至 1×106/ml，將100 μl細胞懸液轉至 5 ml流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μl緩沖液，采用流式細胞儀進行檢測。

1.10 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織和癌旁組織中MAP 4表達情況的比較

肺腺癌組織中MAP4的陽性表達率為56.06%（37/66），明顯高于癌旁組織的19.30%（11/57），差異有統計學意義（χ2=17.371，P＜0.01）。（圖1）

圖1 肺腺癌組織和癌旁組織中MAP 4的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.2 兩組肺腺癌細胞中MAP 4相對表達量的比較

siMAP4組肺腺癌細胞中MAP4的相對表達量為（0.29±0.08），低于siNC組肺腺癌細胞的（0.60±0.12），差異有統計學意義（t=3.723，P＜0.05）。（圖 2）

圖2 Western blot檢測兩組肺腺癌細胞中MAP 4的表達情況

2.3 兩組肺腺癌細胞遷移和侵襲能力的比較

siMAP4組肺腺癌細胞的24 h和48 h未遷移區域分別為（78.25±10.02）%和（62.47±7.26）%，分別明顯高于siNC組肺腺癌細胞的（43.56±8.31）%和（31.32±4.54）%，差異均有統計學意義（t=4.616、4.889，P＜0.01）。siMAP4組肺腺癌細胞的侵襲細胞數目為（102±5）個，明顯少于siNC組肺腺癌細胞的（210±11）個，差異有統計學意義（t=15.481，P＜0.01）。（圖3、圖4）

圖3 細胞劃痕實驗檢測兩組肺腺癌細胞的遷移能力

圖4 Transwell實驗檢測兩組肺腺癌細胞的侵襲能力（結晶紫染色，×400）

2.4 兩組肺腺癌細胞增殖能力的比較

轉染后1～5天，siMAP4組肺腺癌細胞的OD450值與同時間點siNC組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 轉染后 1～ 5天兩組肺腺癌細胞的OD450值（±s）

表1 轉染后 1～ 5天兩組肺腺癌細胞的OD450值（±s）

時間第1天第2天第3天第4天第5天1.93±0.12 3.56±0.37 4.41±0.32 4.22±0.21 4.19±0.19 1.92±0.11 3.43±0.28 4.27±0.33 4.20±0.23 4.03±0.25 siNC組siMAP4組

2.5 兩組肺腺癌細胞凋亡情況的比較

siMAP4組肺腺癌細胞的凋亡率為（34.82±7.65）%，與siNC組肺腺癌細胞的（39.27±8.34）%比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖5）

3 討論

圖5 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測兩組肺腺癌細胞的凋亡情況

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康[7]。非小細胞肺癌占全部肺癌的80%，其中最常見的是肺腺癌[8]。肺腺癌生長較慢，但具有較高的浸潤性和破壞性，并且極易出現血行轉移和淋巴結轉移[9]。遠處轉移和局部復發是肺腺癌患者最主要的死亡原因[10]。近年來隨著醫療技術和理念的進步，腫瘤的分子靶向治療得到越來越廣泛的應用[11]。MAP4屬于微管相關蛋白（microtubule-associated protein，MAP）家族成員，首先發現于小鼠神經母細胞瘤細胞，對裝配、穩定微管具有重要作用[12]。研究表明，下調MAP4的表達可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高化療效果[13]。另有研究發現，肺癌組織中MAP4mRNA與stathminmRNA的比值高于正常肺組織，說明MAP4對診斷肺癌具有指示作用[14]。

微管由微管蛋白及微管相關蛋白組成，是構成細胞骨架的重要成分之一[15]。微管的功能主要受MAP的調節，在細胞收縮、運動及物質運輸中具有重要作用[16]。由于MAP4可提高微管強度、聚集微管，而微管在細胞分裂和細胞運動過程中又具有至關重要的作用，因此MAP4可能與腫瘤細胞的遷移和侵襲具有一定關聯[17]。研究報道，MAP4水平是檢查前列腺癌及判斷前列腺惡性腫瘤侵襲性的潛在指標[18]。還有研究證實，MAP4與口腔鱗狀細胞癌的惡性生物學行為相關[19]。本研究檢測了肺腺癌組織和癌旁組織中MAP4的表達情況，結果發現，肺腺癌組織中MAP4的陽性表達率明顯高于癌旁組織，提示MAP4高表達可能與肺腺癌的發生發展有關。

肺腺癌的遷移和侵襲是一個較為復雜的過程，與多種原癌基因及抑癌基因相關[20]。本研究通過RNA干擾技術調節肺腺癌細胞A549中MAP4的表達水平，結果顯示，下調MAP4的表達可抑制肺腺癌細胞的遷移和侵襲。這可能是由于MAP4具有調節微管的作用，MAP4水平降低導致微管強度減弱，進而引起腫瘤細胞的分裂和運動能力降低，遷移和侵襲能力受到抑制。CCK-8和流式細胞儀檢測結果顯示，MAP4表達水平對肺腺癌細胞的增殖和凋亡無顯著影響，這可能是因為MAP4不參與A549細胞增殖和凋亡相關信號通路的激活。

綜上所述，MAP4在肺腺癌組織中高表達，MAP4高表達可提高肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力，在肺腺癌的發生發展中具有重要作用，本研究暫未發現MAP4對肺腺癌細胞增殖和凋亡的影響，但具體機制還有待更深入的研究。