喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a的表達及臨床意義

侯俊勝，豆彪，陶學勇，翟性友

1河南大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 開封 475000

2解放軍總醫院海南醫院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 三亞572013

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%。近年來，盡管以手術為主的綜合治療方案使喉癌患者預后得到改善，但其遠期生存率并未見明顯提高，尤其是伴頸部淋巴結轉移患者，其5年生存率不足50%[1-2]。闡明喉癌發生發展的分子機制，探尋分子靶向標志物以實現靶向治療是提高喉癌患者生存率的關鍵。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發現的非編碼內源性小分子RNA，對基因表達進行轉錄后的負向調控，研究顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發生發展緊密關聯[3-5]。miRNA-384在多種惡性腫瘤中存在明顯異常表達，被認為是一種抑癌miRNA，能夠抑制腫瘤的侵襲、轉移[6-7]。miRNA-let-7a在肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達下調，也是一種抑癌miRNA，可通過作用于高遷移率族蛋白而發揮抗腫瘤作用[8-9]。但在喉癌中，miRNA-384、miRNA-let-7a表達是否對腫瘤侵襲、轉移有影響，目前尚缺乏相關報道。為此，本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a的表達水平，分析其與患者臨床特征的關系，探討其對預后的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6月至2014年6月在河南大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科經手術病理證實的喉癌患者的病歷資料。所有患者均具有完整病歷資料及隨訪資料，術前均未接受放化療及免疫治療，且均采集喉癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織0.5～1.0 cm）標本。共納入80例喉癌患者，其中，男72例，女8例；年齡36～83歲，中位年齡59歲；病理類型均為喉鱗狀細胞癌，高分化癌48例，中分化癌28例，低分化癌4例；原發部位：聲門上型18例，聲門型52例，聲門下型10例；淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移58例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期31例，Ⅳ期17例。全部標本均于手術切取離體后置入液氮中，轉運至-80℃冰箱中保存。

1.2 儀器與試劑

熒光定量PCR儀購自美國Thermo Forma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；PCR引物由南京金斯瑞公司設計合成；-80℃低溫冰箱購自無錫冠亞恒溫制冷技術有限公司。

1.3 檢測方法

總RNA的提取：①組織勻漿。取組織標本約100 mg，放置到EP管中，加入Trizol試劑1 ml，冰上操作勻漿至液態。靜置5 min后，4℃環境下離心（12 500 r/min，5 min）。②兩相分離。吸取1.5 ml組織上清液到新的離心管（1.5 ml）中，加入200 μl氯仿，輕輕振蕩EP管，混勻，EP管液體為粉紅色乳狀，室溫靜置5 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），此時液體分為3層，其中RNA全部溶解于上層水相。③RNA沉淀。取離心后的上層水相，移至新的EP管（1.5 ml）中，加入異丙醇，充分混勻，靜置10 min，4℃環境下離心（12 000 r/min，10 min）。④RNA洗滌。吸除上清液，可見EP管底部沉淀有白色物質，加入1 ml無水冰乙醇，輕彈EP管底部使白色沉淀物充分洗滌，振蕩，4℃環境下離心（12 000 r/min，15 min）。離心后肉眼可見EP管底部存在少量白色沉淀物質，將上清液棄掉，將EP管置于超凈臺中20 min，使RNA干燥。⑤RNA沉淀重新溶解。采用移液槍往RNA沉淀中加入RNA-free H2O，反復吹打數次，于55～60℃下孵育10 min。取2 μl溶解液進行RNA測定，將得到的RNA溶解液置于-80℃環境下保存。

qRT-PCR檢測喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a的表達：采用qRT-PCR法，以兩步法檢測miRNA-384、miRNA-let-7a表達量，按逆轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應。應用通用的反轉錄條件轉錄目的miRNA，95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，共40個循環。以U6為內參，以2-ΔCt表示miRNA-384、miRNA-let-7a的相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson相關系數法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉癌組織與癌旁正常組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對表達量的比較

喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對表達量均明顯低于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 喉癌組織與癌旁正常組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對表達量的比較（±s）

組織喉癌組織（n=80）癌旁正常組織（n=80）t值P值0.56±0.18 1.37±0.39 16.867 0.000 0.51±0.16 2.36±0.58 27.502 0.000 miRNA-384miRNA-let-7a

2.2 喉癌組織中miRNA-384與miRNA-let- 7 a表達的相關性分析

Pearson相關性分析顯示，喉癌組織中miRNA-384相對表達量與miRNA-let-7a相對表達量呈正相關（r=0.457，P＜0.05）。

2.3 不同臨床特征的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對表達量的比較

臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384相對表達量分別明顯高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（t=4.738、3.567，P＜0.01）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-let-7a相對表達量分別明顯高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（t=3.445、2.991，P＜0.01）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、原發部位、分化程度及有無吸煙史喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a的相對表達量（ n=80）

2.4 生存分析

隨訪截至2019年10月，中位隨訪時間39個月（5～60個月）。根據喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對表達量中位數，定義miRNA-384 0.46為低表達（n=35），＞0.46為高表達（n=45）；并定義miRNA-let-7a≤0.42為低表達（n=31），＞0.42為高表達（n=49）。miRNA-384高表達患者術后5年生存率為84.3%，明顯高于低表達患者的66.2%；miRNA-let-7a高表達患者術后5年生存率為82.9%，明顯高于低表達患者的64.8%，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（圖1、圖2）

3 討論

局部復發及頸部淋巴結轉移是限制喉癌治療效果進一步提高的瓶頸。目前，喉癌的病因仍未完全明確，如何在分子水平闡明其發生發展的分子機制，探尋新的靶向治療方法是臨床研究之熱點。

圖1 miRNA-384高表達（ n=45）與miRNA-384低表達（ n=35）喉癌患者的生存曲線

圖2 miRNA-let- 7 a高表達（ n=49）與miRNA-let- 7 a低表達（ n=31）喉癌患者的生存曲線

miRNA是一類真核生物內源性非編碼單鏈的小RNA分子，長19～23個核苷酸。研究表明，盡管miRNA在人體基因數中僅占2%，卻對30%以上的人體基因表達有著調控作用，介導細胞生長、分化及凋亡等多種生物學過程，與多種疾病的發生、進展緊密關聯[10-11]。miRNA-384被認為是一種腫瘤抑制因子。目前，已在多種腫瘤中發現，miRNA-384表達與腫瘤發生發展密切相關。Chen等[12]研究發現，lncRNA CRNDE通過抑制miRNA-384表達而促進肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲，提示miRNA-384參與了肝癌的發生發展。Zhang等[13]研究顯示，miRNA-384能夠靶向抑制AKT3表達而抑制大腸癌細胞增殖。研究認為，miRNA-384是潛在的抑癌因子，在多種致癌信號通路中發揮著重要的調節作用[14]。且已有研究顯示，喉癌組織中miRNA-384表達明顯降低[15]。本研究顯示，與癌旁正常組織相比，喉癌組織中miRNA-384相對表達量明顯降低，且臨床分期越晚、伴淋巴結轉移患者的喉癌組織中miRNA-384相對表達量相對越低，提示miRNA-384表達下調與喉癌發生、侵襲及轉移密切相關。

miRNA-let-7a作為較早被發現的miRNA家族重要成員，可通過與靶mRNA進行互補配對，抑制蛋白翻譯過程，對內源蛋白表達產生調節作用，進而參與基因調控[16]。在胚胎期組織中，miRNA-let-7a表達較少，而在分化成熟的組織中，其表達逐漸增多。有研究提示，miRNA-let-7a也可能是一種抑癌因子，在一系列致癌信號通路中發揮著重要的調節作用[17]。miRNA-let-7a被發現在多種惡性腫瘤組織中呈低表達，其低表達與腫瘤發生、發展呈正相關，且低表達miRNA-let-7a的癌癥患者生存率較低[18]。眾多證據表明，miRNA-let-7a在惡性腫瘤中有著強大的抑癌基因功能。Tang等[19]研究顯示，miRNA-let-7a可通過抑制丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）表達而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Guo等[20]也發現，miRNA-let-7a可通過下調PKM2表達而抑制宮頸癌的發生發展。Liu等[21]研究表明，miRNA-let-7a可通過介導高遷移率族蛋白A2（high-mobility group protein A2，HMGA2）表達，而對食管癌細胞增殖、遷移產生抑制作用。本研究應用qRT-PCR對喉癌組織及癌旁正常組織中miRNA-let-7a表達水平進行檢測發現，miRNA-let-7a在喉癌組織中表達明顯降低，且晚期、有淋巴結轉移患者的喉癌組織中miRNA-let-7a相對表達量分別明顯低于早期、無淋巴結轉移患者，提示miRNA-let-7a表達下調，可能參與了喉癌的發生發展，這可能是喉癌發生的重要分子機制，有望成為靶向治療的新靶點。本研究對miRNA-384與miRNA-let-7a的相對表達量進行相關性分析顯示，二者呈正相關，二者表達下調可能共同促進了喉癌的發生發展。此外，本研究還對患者5年生存情況與這兩種基因表達之間的關系進行了分析，結果顯示，miRNA-384高表達患者術后5年生存率為84.3%，明顯高于低表達患者的66.2%；miRNA-let-7a高表達患者術后5年生存率為82.9%，明顯高于低表達患者的64.8%；提示miRNA-384、miRNA-let-7a高表達有利于患者預后。由此推測miRNA-384與miRNA-let-7a可作為判斷喉癌病理進程及預后的新型分子標志物。綜上所述，本研究顯示，miRNA-384、miRNA-let-7a在喉癌組織中均呈低表達，與腫瘤發生、侵襲、轉移及預后密切相關，這將有助于深入研究喉癌的發病機制，并為臨床診療提供更多策略及思路。