貉感染停乳鏈球菌的實(shí)驗(yàn)分析

蓋玉強(qiáng)，張鵬程，韓先杰

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109

停乳鏈球菌是鏈球菌屬的一員，是牛、山羊和綿羊急性、慢性乳腺炎的病原菌之一[1]，分停乳鏈球菌停乳亞種和停乳鏈球菌類馬亞種兩個(gè)亞種[2]。該菌能通過皮膚傷口、臍帶和扁桃體等進(jìn)入血液，隨后導(dǎo)致菌血癥或敗血癥[3]。2020年8月初，某養(yǎng)貉場(chǎng)部分100日齡左右的幼貉發(fā)病，表現(xiàn)食欲不振、精神萎靡、消瘦、咳嗽，個(gè)別幼貉還表現(xiàn)腹瀉、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等臨床癥狀，數(shù)日之后死亡，發(fā)病率約為6%。剖檢發(fā)現(xiàn)主要病變?yōu)榉闻K腫大、表面有出血點(diǎn)，肝、脾腫大、淤血，內(nèi)臟淋巴結(jié)腫大、出血。為了探明幼貉的發(fā)病原因，本文從病死貉的肺臟、脾臟中分離出一株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌革蘭氏染色及細(xì)菌16S rDNA基因鑒定，最后確認(rèn)該分離菌為停乳鏈球菌類馬亞種。該菌對(duì)小鼠有致病性，對(duì)阿莫西林等藥物敏感，用敏感藥物治療控制病情?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

某養(yǎng)貉場(chǎng)發(fā)病死亡仔幼貉的肺、脾臟。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染液試劑盒、綿羊血平板、腦心浸液培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、葡糖糖、蔗糖等生化反應(yīng)管等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix Taq等購自寶生物工程（大連）有限公司；核酸染料、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。藥敏紙片由齊魯動(dòng)物保健品有限公司提供，昆明系小白鼠購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

對(duì)病死貉的體表消毒后進(jìn)行解剖，無菌取肺臟、脾臟，在綿羊血平板上進(jìn)行三區(qū)劃線、37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌落形態(tài)。另挑取單個(gè)菌落接種到已滅菌的腦心浸液肉湯中培養(yǎng)36 h。

1.2.2 生化鑒定

對(duì)分離菌分別進(jìn)行CAMP試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷、七葉苷等代謝試驗(yàn)。

1.2.3 16S rDNA鑒定

根據(jù)多種革蘭氏陽性菌16S rDNA基因序列，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)擴(kuò)增革蘭氏陽性菌16S rDNA的通用引物：上游5′-CCTGCTGTTAGAGAAGAATGA-3′，下游5′-AACACCTGTCACTCCTGCC-3′，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。采用煮沸法提取細(xì)菌DNA作為模板，進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）為：Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1.5 μL、無菌去離子水9 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃、4min；變性94 ℃、30 s；退火53.6 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃、7 min，4 ℃終止反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外投射儀觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序

將PCR產(chǎn)物送至青島天澤生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，將所得序列用NCBI的Blast工具進(jìn)行基因序列的同源性對(duì)比。

1.2.5 致病性試驗(yàn)

取小白鼠6只，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3只。試驗(yàn)組每組腹腔注射含菌腦心浸液0.2 mL，對(duì)照組注射等量滅菌腦心浸液。接種后觀察小鼠的臨診癥狀、病理變化，并進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將100 μL含菌腦心浸液均勻的涂布于含5%馬血清的TSA平板，在培養(yǎng)基的表面貼上青霉素G等藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)36 h，隨后測(cè)量抑菌圈的直徑，按照標(biāo)準(zhǔn)判定藥物的敏感性[4]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)特征

分離菌在綿羊鮮血平板上培養(yǎng)24 h后似針尖大小，培養(yǎng)48 h后可見呈圓形、直徑約0.6～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊的菌落，呈β型溶血。經(jīng)革蘭氏染色，細(xì)菌為G+球菌，呈圓形或卵圓形，少數(shù)單個(gè)或者成對(duì)存在，多成短鏈狀排列。

2.2 分離菌生化試驗(yàn)

分離菌CAMP試驗(yàn)陰性、VP試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，能利用水楊苷，不利用乳糖、菊糖、甘露醇、山梨醇和七葉苷（見表1）。

表1 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rDNA基因擴(kuò)增與序列分析

分離菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外透射儀觀察，擴(kuò)增的特異性條帶大小約為746 bp，與預(yù)期擴(kuò)增大小相符。經(jīng)Blast同源性比較，分離菌的16S rDNA序列與停乳鏈球菌似馬亞種（序列號(hào)MN880121）同源性達(dá)到99.72%。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組接種含菌肉湯12 h后，小鼠表現(xiàn)精神萎靡、不愿活動(dòng)、身體蜷縮、呼吸急促，3只攻毒小鼠在48 h內(nèi)死亡。死亡小鼠解剖病變主要表現(xiàn)肝、脾和腎腫脹、淤血，肺腫脹、充血。對(duì)照組小鼠一直健康存活。取死亡小鼠的病變組織接種綿羊鮮血平板，分離的細(xì)菌菌落形態(tài)和菌體染色特征與2.1的結(jié)果一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)量所用藥敏紙片對(duì)分離菌的抑菌圈直徑，依據(jù)藥物的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，該菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋和恩諾沙星敏感，對(duì)氟苯尼考、卡那霉素為中敏，對(duì)林可霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B耐藥。選用阿莫西林進(jìn)行治療。

3 討論

本文從發(fā)病仔貉的肺臟、脾臟分離一株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌革蘭氏染色、細(xì)菌16S rDNA基因測(cè)序和同源性比較，確定病原為停乳鏈球菌似馬亞種。為了進(jìn)一步探明仔貉感染停乳鏈球菌的原因，經(jīng)過深入調(diào)查得知，發(fā)病的幼貉均為出生較晚的一批，這些幼貉出生后表現(xiàn)發(fā)育不良，養(yǎng)殖場(chǎng)為了增加幼貉的營養(yǎng)，在飼喂日常配制飼料以外，還為其提供羊奶，羊奶來自同村一個(gè)山羊養(yǎng)殖戶。通過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對(duì)該山羊所產(chǎn)羊奶的微生物檢測(cè)，檢測(cè)出的停乳鏈球菌與發(fā)病幼貉體內(nèi)的一致。

立即對(duì)患病幼貉進(jìn)行隔離治療，每只幼貉按15 mg/kg注射阿莫西林，每天1次，連用3 d。同時(shí)用0.5%的過氧乙酸對(duì)籠具及籠下的糞便、毛屑等消毒。對(duì)幼貉停喂生羊奶，將生羊奶煮沸10 min待冷卻后再飼喂。采取上述措施后1周左右病情被控制，再無新的病例發(fā)生。