表觀遺傳試劑誘導滇重樓內生真菌Hypomyces sp.CLG4次生代謝產物的研究

婁水珠，朱婭寧，馬肖燕，李文義，杜剛，楊海英，汪偉光

(1.云南民族大學 化學與環境學院，云南 昆明 650500;2.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

植物內生真菌是指存活于健康植物組織中，卻不會使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物[1]，它是植物微生態系統的重要組成部分.宿主植物與內生真菌長期協同進化，互利共生[2]，使得內生真菌往往可以產生結構豐富的次生代謝產物.研究發現，在實驗培養條件下，內生真菌微生物天然產物代謝途徑的很多基因或基因簇都是沉默的.因此，激活這些沉默基因或基因簇將有可能產生新的天然產物.如何激活植物內生真菌中沉默的天然產物生物合成基因或基因簇成為當下研究的熱點問題[3].

利用化學表觀遺傳學方法來發現新天然產物是一種有效的策略，其機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等[4].其中，組蛋白去乙酰化酶抑制能夠使組蛋白去乙酰化、染色質卷縮，抑制轉錄，沉默基因，抑制細胞內多種信號通路、凋亡相關基因以及細胞黏附轉移相關基因表達，激活沉默基因[5]，代表修飾劑有伏立諾他、帕比司他、恩替諾特和西達本胺等.研究表明，通過化學表觀遺傳修飾，可以改變真菌次級代謝的分子機制，達到基因沉默或基因表達的目的[6-7].Cichewicz課題組于2008年最先提出運用化學表觀遺傳修飾劑來抑制真菌中影響表觀遺傳的酶類激活一些沉默基因的表達，從而誘導真菌能產生未知的次級代謝產物，并且分離得到結構新穎的骨架[8].2011年Asai對2株昆蟲內生真菌Torrubiellaluteorostrata和Cordycepsannullata進行了化學表觀遺傳修飾劑作用下的研究，得到3個結構新穎的新化合物色氨酸異戊二烯類化合物[9].2013年Asai研究組在對1株由芍藥的葉片中分離得到的植物內生真菌Graphiopaischlorocephala的研究中，在其培養基中添加煙酰胺進行發酵，最終從發酵產物中分離鑒定了3個二苯甲酮類化合物[10]，該系列化合物均具有新穎的化學結構.本課題組前期也從滇重樓內生真菌分離得到Phomopsissp. 0391對其進行組蛋白脫乙酰酶抑制劑誘導，得到新化合物13-angeloyloxy-diplosporin[11]以及雜色曲霉Aspergillusversicolor0312中的過表達產生新的化合物versicolor A.

本文對采自云南省呈貢區的野生重樓樣品中的1株菌寄生屬 (Hypomyces) 內生真菌H. sp. CLG4 進行了化學表觀遺傳學誘導發酵，對誘導后的次生代謝產物進行分離純化得到6個化合物 (圖1)，化合物1～3、5和6為首次從滇重樓內生真菌中分離得到.研究表明，該方法為激活藥用植物內生真菌，獲取更多結構多樣的天然產物提供了一定參考.

圖1 CLG4表觀遺傳學誘導產生次生代謝產物結構

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

高效液相色譜Aglient 1200 (美國Aglient公司);Avance III HD 600 (德國Bruker公司);Avance III HD 800 MHz (德國Bruker公司);Agilent，ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×9.4 nm, 5 μm, Aglient公司)，LDZX-40B 立式自動電熱蒸汽滅菌鍋 (上海博訊實業有限公司醫療設備廠);SW-CJ-ZFD 型無菌操作臺 (蘇凈集團安泰公司);HP-900 型隔水式恒溫培養箱 (廣東省醫療器械廠);ZHWY-2102 恒溫培養振蕩器 (上海智城分析儀器制造有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循環水式真空泵 (鞏義市英峪予華儀器廠);S20092819 型旋轉蒸發儀 (上海亞榮).

1.2 實驗材料

柱層析法使用硅膠 (200～300目，青島海事)、恩替諾特 (湖北信康醫藥化工有限公司)、RP-18凝膠 (40～63 μm，YMC)、乙腈 (色譜純)、甲醇 (色譜純)、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、娃哈哈純凈水、二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(均為工業級)、DMSO為分析純.

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基 (PDA) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

馬鈴薯葡萄糖液體培養基 (PDB) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

恩替諾特終濃度為 500 μmoL/mL.

1.3 菌株的來源和鑒定

野生重樓采自云南省呈貢區梁王山的野生重樓，經云南民族大學杜剛副教授鑒定為滇重樓(P.polyphyllavar.yunnanensis).經實驗室分離鑒定，菌寄生屬內生真菌 (H.sp. CLG4) 菌株從新鮮的重樓根部分離，且經分子克隆手段鑒定，其ITS NCBI登錄號為：MT604986,菌株保存于云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室.

1.4 菌株表觀遺傳篩選及發酵

將常溫條件下保藏的菌株取出，經平板活化后備用.配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(PDB)，按照 10∶1 的接種量進行接種.于 30 ℃ 200 r/min 的條件下培養 3 d，將種子液分別接種2瓶 100 mL PDB培養基中，控制其他條件一致，空白組不加恩替諾特，實驗組加入 100 μL 恩替諾特，培養 3 d.無菌條件下，取出 1 mL 菌液，乙酸乙酯萃取2次，每次 500 μL 乙酸乙酯，2次萃取的乙酸乙酯濃縮蒸干后用 100 μL 色譜甲醇溶解，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清 10 μL 進行HPLC分析 (0～ 30 min，乙腈10%～100%梯度；流速 1 mL/min，進樣體積 10 μL).發現產生很多次生代謝產物，因此，以試驗組同樣條件擴大發酵 10 L.

1.5 CLG4次級代謝產物分離純化

發酵液 10 L，用多層紗布過濾，分離得到濾液和菌絲體.濾液用等體積的乙酸乙酯萃取6次，菌絲體用丙酮超聲提取，提取液濃縮至無丙酮后所得的水相再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并兩部分的乙酸乙酯萃取物，在 40 ℃ 下減壓蒸餾得浸膏 15 g，經硅膠柱 (200～300目) 層析，分別以純二氯甲烷、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、1∶1)、純甲醇梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.10，共10個組分.Fr.2以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統梯度洗脫，通過硅膠柱色譜反復純化得到化合物3(12.2 mg).Fr.3以二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統梯度洗脫，通過硅膠柱色譜，RP-18反向柱反復純化得到化合物1(109.0 mg)，6(114.4 mg)，4(19.5 mg)，Fr.4以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統梯度洗脫，二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統梯度洗脫，通過硅膠柱色譜反復純化得到化合物5(28.3 mg)，2(10.1 mg).

2 結果與分析

2.1 表觀遺傳篩選結果

利用恩替諾特對菌株進行表觀遺傳學篩選.對比空白組和實驗組 (加入恩替諾特)，HPLC在 210 nm 處檢測發現菌株CLG4最敏感，如圖2所示.

圖2 CLG4代謝物HPLC分析圖

對比上述2組實驗結果，可以看出加入恩替諾特后，CLG4的代謝產物組成發生顯著變化，產生新的產物峰1～6.

2.2 結構鑒定

化合物2黃色固體，分子式C11H12O5,1H NMR(800 MHz,Acetone-d6)δ: 1.50 (3H,d,J=6.3Hz,3-CH3),2.87 (1H,m,H-4a),2.96 (1H,dd,J=16.2,3.2 Hz,H-4b),3.90 (3H,s,7-OCH3),4.72 (1H,m,H-3),6.53 (1H,s,H-5),11.05 (1H,s,8-OH).13C NMR (200 MHz,Acetone-d6)δ: 20.8 (CH3-3),34.6 (C-4),56.5 (OCH3-7),77.1 (C-3),103.0 (C-8a),103.2 (C-5),132 (C-7),133.7 (C-4a),151.1 (C-8),154.0 (C-6),170.9 (C-1).以上數據與文獻[13]報道的數據基本一致，因此鑒定為6-demethylkigelin.

化合物5黃色固體，分子式C7H8O2,1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.58 (1H,d,J= 8.5 Hz,H-6),6.45 (1H,dd,J= 8.5,2.9 Hz,H-5),6.54 (1H,d,J= 2.9 Hz,H-3),2.12 (3H,s,CH3).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:149.3 (C-1),126.5(C-2),116.4 (C-3),150.9 (C-4),113.9(C-5),118.4(C-6),16.4(CH3).以上數據與文獻[15]報道一致，因此鑒定為pyrolin.

3 結語

本實驗采用組蛋白去乙酰化修飾劑恩替諾特(Entinostat)對滇重樓內生真菌CLG4(Hypomyces.sp)進行化學表觀遺傳誘導，發現與未誘導的滇重樓內生真菌有顯著差別.對誘導后的菌株產生次生代謝產物分離純化，得到6個化合物，化合物1～3，5和6為首次從該內生真菌代謝產物中分離得到.化合物2為terrein，它是青霉和曲霉真菌的著名代謝物，具有廣譜的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和酶抑制作用[13]；化合物3為(3R)-6-methoxymellein，它是一種常見的植物抗毒素，由胡蘿卜根產生，這種化合物具有廣泛的抗菌譜，能抑制幾種真菌的生長，如酵母菌和細菌[14]；化合物4為(3R)-6,7-dimethoxymellein，它對人類病原真菌 (皮膚癬菌)、犬小孢子菌和長毛癬菌具有顯著的抗真菌活性[14]；化合物6為6-demethylkigelin，它能抑制生長[16].研究結果表明，化學表觀遺傳誘導方法，可使真菌的代謝產物類型發生顯著改變，推測這是表觀遺傳修飾劑誘導改變真菌代謝途徑的結果.表觀遺傳誘導為研究藥用內生真菌在實驗室培養條件下產生新的代謝產物提供了一定借鑒.