植物提取物對瘤胃體外發酵性能和甲烷產生的影響

李 涵

（濮陽職業技術學院，河南濮陽 457000）

大氣中包括甲烷在內的溫室氣體濃度增加會導致全球變暖，這是近年來人們關注的主要問題。近年，畜牧業中反芻動物排放的甲烷引起重視。甲烷是一種比二氧化碳強23倍的溫室氣體，反芻動物腸道發酵產生的甲烷主要是由于兼性厭氧條件對細菌、原生動物和真菌的生長有利（孫福昱等，2018）。瘤胃內的甲烷排放被認為是一個能量浪費過程（Johnson等，1995）。許多化學食品添加劑已經被證明具有減降低瘤胃甲烷排放的潛力，但它們要么對宿主動物有毒，要么對有益的瘤胃微生物產生副作用。為降低反芻動物甲烷排放，選擇具有生物活性的化合物來降低原生動物活性已成為一種研究方法。但在供人類食用的動物身上使用化學物質的風險越來越受到公眾關注。Kim等（2012）研究表明，植物提取物可以控制瘤胃微生物多樣性，是降低甲烷排放的較好替代選擇，這種方法也是動物營養學家認為最有潛力的策略。本研究旨在評估松樹和銀杏葉提取物對瘤胃發酵、瘤胃產甲烷和產甲烷相關微生物的體外作用。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與體外發酵 以100 g/300 mL的溶劑，用70%的乙醇制備松樹和銀杏葉提取物。將含70%乙醇的燒瓶塞住，在39℃的旋轉蒸發儀上孵育24 h。從壓碎的葉子中提取松樹和銀杏葉汁液，然后用濾紙過濾，收集濾液，用旋轉蒸發器將70%乙醇溶劑除去，4℃保存備用。從5頭500 kg重、帶有瘤胃瘺管荷斯坦奶牛瘤胃中收集瘤胃液，瘤胃液經四層紗布過濾后分為5組，對照組不添加植物提取物，T1組添加5%松樹液，T2組添加5%松樹70%乙醇提取物，T3組添加5%銀杏葉液，T4組添加5%銀杏葉70%乙醇提取物。將瘤胃液注入血清瓶，置于39℃的振蕩培養箱中培養24 h。體外試驗每組3個重復。孵育后分別測定瘤胃液pH、揮發性脂肪酸總量、乙酸、丙酸和丁酸含量。參考王榮等（2019）的研究方法測定瘤胃發酵氣體生成總量、甲烷和二氧化碳量。

1.2 微生物定量 從培養液中取30 mL樣品，用寬口徑的移液管取1.0 mL的溶液，以確保樣品中含有液體和消化液，用核酸提取試劑盒提取RNA。參考Ohene-Adjei等（2008）的方法設計纖毛蟲、產甲烷菌和產琥鉑酸絲狀桿菌的引物，并進行實時熒光定量PCR分析，測定結果以對照組進行歸一化，處理組表示為相對于對照組的相對表達量。

1.3 統計分析 數據分析采用SAS統計分析軟件的一般線性模型，利用Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 植物提取物對瘤胃體外發酵特征的影響由表1可知，松樹和銀杏葉提取物顯著影響瘤胃體外發酵總氣體產量、甲烷排放和二氧化碳排放量（P＜0.05），其中松樹和銀杏葉乙醇提取物較對照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量（P＜0.05），而5%松樹液和5%銀杏葉乙醇提取物較對照組瘤胃體外發酵二氧化碳產量顯著降低了31.17%和33.02%（P＜0.05）。

由表2可知，銀杏葉液和銀杏葉乙醇提取物組瘤胃pH較對照組顯著提高了0.94%和0.79%（P＜0.05），而對照組揮發性脂肪酸總量最高，較處理組分別顯著提高10.39%、11.12%、8.58%和9.62%（P＜0.05），處理組間對揮發性脂肪酸總量的影響無顯著差異（P＞0.05）。此外，對照組乙酸、丙酸和丁酸含量也表現最高，其中乙酸含量較T1、T2和T4組分別顯著提高9.15%、10.30%和9.80%（P＜0.05），丙酸含量較T1和T2組分別顯著提高11.69%和12.62%（P＜0.05），丁酸含量較處理組分別顯著提高12.28%、13.52%、10.36%和10.44%（P＜0.05）。T1組乙酸與丙酸比值最高，分別較對照組、T3和T4組顯著提高2.55%、1.52% 和 3.08%（P＜ 0.05）。

2.2 植物提取物對瘤胃體外發酵微生物相對表達量的影響 由表3可知，與對照組相比，處理組瘤胃體外發酵中纖毛蟲、產甲烷菌和產琥鉑酸絲狀桿菌的相對表達量降低了25%～49%（P＜ 0.05）。

3 討論

體外瘤胃發酵可能受植物提取物的用量和提取溶劑的影響，如Pfister等（1992）指出，牛飼料中添加15%～30%的松樹葉似乎是瘤胃發酵毒性作用的閾值。但植物提取物對牛消化性能的不良影響還有待進一步研究。在本研究中，松樹和銀杏葉乙醇提取物較對照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量。銀杏葉提取物對pH的影響也顯著，同時各植物提取物的揮發性脂肪酸總量均顯著低于對照組，這表明氫氣產物可能被用作瘤胃產甲烷菌轉移甲烷的底物。因此，氫氣對反芻動物的微生物生態系統具有重要意義。此外，由琥珀酸形成丙酸會導致氫氣的產甲烷能力降低。腸內發酵產生的氫氣是反芻動物甲烷生成的前體，調控氫氣而非甲烷是控制反芻動物甲烷排放的關鍵。本研究結果表明，植物提取物特別是銀杏葉乙醇提取物可能影響甲烷生成，降低瘤胃甲烷排放。

表1 植物提取物對瘤胃體外發酵氣體生成的影響 mL/g

表2 植物提取物對瘤胃體外發酵特性的影響

表3 植物提取物對瘤胃體外發酵微生物相對表達量的影響

本試驗使用的松樹和銀杏葉提取物具有驅蟲劑、抗菌和抗氧化活性，并已被用作藥物用途（Lee等，2006）。松樹和銀杏葉中的次生化合物（如黃酮類化合物）可能調控瘤胃發酵，抑制瘤胃內的微生物，尤其是原生動物。特別是銀杏葉提取物具有天然的殺蟲作用，可能還具有驅蟲劑和抗菌作用。Yoo等（2004）在離體試驗模型中對松樹葉提取物的抗氧化活性進行了研究，發現松樹提取物中總多酚類化合物的含量為1.61%。本研究通過實時熒光定量PCR分析了體外瘤胃發酵液中微生物的表達量。一些瘤胃纖毛蟲和產甲烷菌被認為是共生體，本研究結果表明，補充松樹和銀杏葉提取物可降低纖毛蟲數量，抑制甲烷生成，進而降低瘤胃甲烷排放。Broudiscou等（2000）篩選了植物提取物，對其產甲烷作用、發酵模式和原生動物數量進行了評估，結果發現，植物提取物對產甲烷有輕微的抑制作用。Jo等（1997）在體研究了牧草（紫花苜蓿、金合歡葉和松樹葉）對韓國山羊采食量和消化率的影響，體內研究結果表明，松樹葉組的干物質攝入量和干物質消化率均低于其他飼料，但本試驗體外研究結果未顯示添加植物提取物對產琥珀酸絲狀桿菌基因表達有不利影響。

4 結論

植物提取物（松樹和銀杏葉乙醇提取物）降低了瘤胃體外發酵甲烷產量，但有必要進一步探討植物提取物的劑量和植物提取物是否對瘤胃具有副作用。