烏頭堿下調miR-23a誘導凋亡抑制胃腺癌細胞系MGC803增殖

汝 晶 陳 嶸 鄭 梅 李明泓 張 珊

云南中醫藥大學基礎醫學院，云南 昆明 650500

胃癌是一種在全球范圍內預后差、致死率高的惡性消化系統腫瘤，大約90%的胃部腫瘤都屬于腺瘤[1]。一般認為外科手術是對其進行根治的唯一療法，同時輔以放化療。然而，由于早期胃癌的診斷率低，大多數患者發現就是進展期或晚期，錯過最佳的手術窗口期，增加胃癌的致死率[2]。目前在臨床上主要使用卡培他濱、順鉑、氟尿嘧啶等在內的化療藥物進行聯合治療。但化療藥物副作用明顯，且長期使用會損害機體的多個器官系統[3]。中藥具有良好的抗腫瘤活性，且毒副作用小。生物堿類是中藥有效成分中的重要組成之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種生物活性[4]。烏頭堿(aconitine)是存在于川烏、草烏、附子等藥用植物的一種生物堿。傳統中醫理論認為，烏頭類中藥具有回陽救逆、溫陽散寒等療效；近些年臨床應用和實驗研究表明，其在抗腫瘤、強心、鎮痛、調節免疫等方面具有特殊的功效。

烏頭堿對包括胃癌在內的多種惡心腫瘤都具有抑制腫瘤細胞增殖以及侵襲的作用[5-6]。將烏頭堿注射液稀釋后接種胃癌FC的615純系小鼠，結果顯示實驗組瘤重抑制率顯著高于對照組[7]；王冠庭[8]發現以烏頭堿注射液治療晚期胃癌患者，3個療程后，患者癥狀改善，梗阻癥狀消失。然而目前烏頭堿在臨床上的應用卻受到限制，一方面是由于其使用劑量及毒性；另一方面則是其抗腫瘤作用機制的研究還十分有限。

miR-23a是定位于人19號染色體的一種非編碼微小RNA，與胃癌、乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的發生發展相關，被視為一個癌基因[9-11]。利用生物信息學方法(綜合TargetScan、MirBase兩個網站信息)預測出IRF1為miR-23a的可能靶基因，且已知報道miR-23a在胃腺癌組織中高表達，并通過下調其下游靶蛋白干擾素調節因子1(IRF1)參與調節胃腺癌細胞的增殖[12-13]，兩者之間的靶定關系在肝癌細胞中也同樣存在[14]。而烏頭堿的抑癌作用是否與參與調節miR-23a及其通路相關，這一點仍需進一步研究。本研究在細胞及分子水平，使用烏頭堿對細胞進行處理，通過觀察細胞增殖與凋亡情況，檢測目標基因及靶蛋白水平的變化，探討烏頭堿抗腫瘤作用miRNA水平的機制，為臨床上合理應用烏頭堿治療胃癌提供相關的實驗基礎與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 烏頭堿(批號BBP03866，云南西力生物有限公司)：取烏頭堿20.3 mg，加入1.015 mL三氯甲烷，配制成20 mg/mL的母液，然后按一定的比例分別稀釋成濃度為0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的稀釋液備用；三氯甲烷(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；MTT(SIGMA,美國)；DMSO(SIGMA,美國)結晶紫(SIGMA,美國); 4%多聚甲醛(北京鼎國，北京)；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche, 瑞士)；RPMI-1640培養基(GIBCO, 美國)；胎牛血清(GIBCO, 美國)；IRF1抗體、GAPDH抗體(天津賽爾生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa, 日本)；Real-time PCR引物(miR-23a forward: 5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′及miR-23a-3p-Reverse:5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′；陰性對照U6 forward:5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′及U6-Reverse: 5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′)購自昆明品品生物科技有限公司。

1.1.2 細胞株 胃腺癌細胞系MGC803購自天津賽爾生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃，5% CO2培養箱內培養。

1.2 方法

1.2.1 烏頭堿適宜作用濃度的篩選(MMT法) 將生長狀態良好的MGC803細胞接種于96孔板(細胞數約8×103個)，細胞完全貼壁后分別更換為濃度梯度稀釋的烏頭堿溶液100 μL，繼續培養0、24、48、72 h，另設溶劑對照組；分別在0、24、48、72 h后，每孔加10 μL 濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h；后終止培養并棄掉原培養液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min；在酶聯免疫檢測儀上波長為490 nm處測出各孔的吸光度值進行細胞活力檢測。根據以下公式計算烏頭堿對MGC803細胞的存活率：(實驗組OD-空白對照OD)/(對照組OD-空白對照OD)]×100%。

1.2.2 集落形成實驗檢測腫瘤細胞增殖能力 收集對數期MGC803細胞，接種于12孔板中，設置對照組和實驗組(烏頭堿處理)，每孔細胞數約150個細胞，每組3個平行，培養24 h后，對照組每孔加入1 mL正常培養基，實驗組加入1 mL濃度為60 μg/mL的烏頭堿稀釋溶液，每3天換液1次，培養14 d；后結晶紫染色，顯微鏡下計數每孔大于50個以上的集落數目，計算集落形成率。

1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡水平 選取生長狀態良好且處于對數期的MGC803細胞，消化計數后接種于24孔板內，培養24 h，實驗組加入濃度為60 μg/mL的烏頭堿溶液1 mL，對照組不加藥，繼續培養48 h。后棄去原培養液，用PBS清洗兩遍，待細胞自然晾干后進行樣本固定；樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后加入蛋白酶K滅活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒溫箱中避光孵育60 min。把處理好的樣本PBS漂洗3次，每次5 min；用無菌雙蒸水將1 μg/mL DAPI染液儲存液稀釋1000倍，每孔加40 μL，室溫避光染色5 min。用無菌雙蒸水于室溫洗2次，5 min/次。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光代表細胞凋亡，藍色熒光代表生存細胞。

1.2.4 Real-time RCR檢測miR-23a的表達水平 收集細胞樣本加入1 mL Trizol裂解，提取細胞中的總RNA，經紫外分光光度計測量RNA濃度后，將合格的RNA進行反轉錄，以得到對應的cDNA，miR-23a-RT:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACGGAAAT3′。熒光實時定量PCR反應體系：總體積為20 μL，包括cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、SYBRGREEN 10 μL，其余用ddH2O補齊。反應條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。正向引物序列：5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′，反向引物序列：5′ CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′。對照組U6正向引物序列：5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′，反向引物序列：5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′。封閉miR-23a序列，ASO-23a序列為：5′GGAAATCCCTGGCAATGTGAT3′；ASO-NC序列為：5′CAGTACTTTTGTGTAGTACAA3′。

1.2.5 Western blot檢測IRF1蛋白的表達量 按照實驗組與對照組分別收集細胞，后加入RIPA裂解液對蛋白質進行抽提。配置10%的SDS-PAGE凝膠，將處理好的蛋白樣品取適量上樣，恒壓80 V電泳2.5 h，對目的蛋白進行分離。后轉膜并用5%的脫脂奶粉溶液進行封閉，然后一抗4 ℃結合過夜，1×TBST侵洗3次后加入二抗，室溫作用1.5 h。最后用Western LightningTMEnhanced Chemiluminescence Substrate檢測顯影，將曝光后進行定影處理的膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統進行攝像，分析內源性IRF1條帶的亮度值。

2 結果

2.1 烏頭堿抑制胃腺癌細胞MGC803的增殖 已知烏頭堿(圖1A)具有一定的細胞毒性[15]，為檢測其對胃腺癌細胞MGC803增殖的影響，首先將制備的烏頭堿母液(20 mg/mL)按一定的濃度梯度進行稀釋(0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL)，利用MMT實驗對不同濃度的烏頭堿溶液對細胞活性的影響進行檢測，并計算存活率(圖1A)。如圖1B所示，烏頭堿對MGC803細胞體外增殖有著明顯的抑制作用，并且隨著作用濃度和作用時間的延長，其抑制作用增強，具有濃度和時間的依賴性。烏頭堿作用MGC803細胞48 h后應用GraphPad Prism 5.0計算出的IC50值為(37.76±1.65)μg/mL，后續實驗中選擇40 μg/mL作為實驗組作用的藥物濃度。為進一步證實烏頭堿抑制癌細胞增殖的作用，集落形成實驗顯示，與對照組比較實驗組細胞集落形成能力下降(圖1B)，且具有顯著統計學差異。

2.2 烏頭堿可誘導細胞凋亡抑制胃腺癌細胞增殖細胞 凋亡是細胞程序性死亡多種形式中研究最為深入的一種。細胞凋亡作為一種重要的細胞死亡形式，當其發生失調時，可打破細胞生長與死亡之間的平衡，是腫瘤發生的重要機制之一[16]。為了明確烏頭堿在結果2.1中所表現出的抑癌作用是否與參與細胞凋亡有關，利用TUNEL實驗進行檢測。如圖2A所示，烏頭堿處理組與對照組相比，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數量增加，凋亡指數顯示兩組存在顯著統計學差異(圖2B)。

2.3 烏頭堿下調內源性miR-23a的表達間接上調其下游靶基因IRF1的水平 大量研究證實miR-23a在包括胃癌在內的多種腫瘤的發生發展過程中扮演癌基因的角色。在胃腺癌細胞MGC803中，miR-23a可通過下調IRF1抑制細胞凋亡[13]。為了研究烏頭堿誘導MGC803發生細胞凋亡與miR-23a及其下游靶基因的關系，設置實驗組與對照組，通過Real-time PCR檢測烏頭堿對內源性miR-23a表達的影響，以及利用Western blot檢測烏頭堿間接對miR-23a下游靶基因IRF1表達的影響。結果如圖3顯示，經烏頭堿處理后，內源性miR-23表達下調(圖3A)，同時IRF1表達上調(圖3B，3C)。這說明烏頭堿通可過參與調節miR-23a抑制細胞凋亡。

2.4 封閉內源性miR-23a后經烏頭堿處理細胞凋亡加強 為了進一步明確烏頭堿誘導胃腺癌細胞凋亡與調節miR-23a的關系，通過反義miR-23a寡聚核苷酸封閉內源性miR-23a，同時設置對照組進行實驗。首先，對反義miR-23a寡聚核苷酸的有效性進行檢測，同事發現轉染ASO-23a后再經烏頭堿處理，miR-23a的表達水平與對照組相比進一步降低(圖4A)。將對照組(ASO-NC)及實驗組(ASO-23a)分別轉染細胞，5% CO2 孵箱37℃培養6h后對照組及實驗組加入烏頭堿稀釋液，繼續培養至48h利用TUNEL對細胞凋亡水平進行檢測。結果如圖4B、4C所示，首先不加藥時，轉染ASO-23a與轉染ASO-NC相比細胞凋亡水平升高，反向驗證miR-23a可抑制細胞凋亡；而封閉內源性miR-23a后，加藥組與非加藥組相比，細胞凋亡明顯加強說明加藥后內源性miR-23a表達的進一步下降促進細胞凋亡的進一步發生，同時也提示烏頭堿誘導細胞凋亡可能與調節miR-23a以外的其他活動相關。

3 討論

烏頭類中藥具有很高的藥用價值，其活性成分中的一大類為烏頭類生物堿，烏頭堿即為其中一種。以近些年備受關注的miRNA作為切入點，研究中藥活性成分的作用機制具有重要意義。筆者從miRNA水平揭示了烏頭堿抑制胃腺癌細胞增殖的新機制，即烏頭堿可通過下調癌基因miR-23a的水平，間接上調其下游靶基因IRF1的表達，從而誘導胃腺癌細胞MGC803發生凋亡發揮抗腫瘤作用。

已知報道miR-23a及其下游多個靶基因均可參與腫瘤的發生發展[11,17-18]，那么烏頭堿抗胃癌作用的發揮除本文研究的IRF1以外是否與調節其他下游蛋白相關，從而實現一種網絡化調控，這一點仍需進一步研究。值得注意的是，IRF1還可激活caspase1、caspase3、caspase7、以及caspase8[19-20]，而其他程序性細胞死亡形式也存在caspase依賴途徑，同時隨著近些年研究的深入，多種程序性細胞死亡形式之間的聯系被逐漸揭示，比如細胞凋亡、細胞自噬、細胞鐵死亡等均可參與腫瘤的發生發展，同時發生機制也有交叉[21]。有報道指出烏頭堿也可誘導小鼠肝細胞發生細胞自噬[22]，提示對中藥活性成分作用機制的研究可以從不同細胞死亡形式入手。另外，烏頭堿還具有抗感染及抗炎作用，幽門螺旋桿菌的感染與胃癌的發生關系密切[23-24]，因此烏頭堿抑制胃癌的作用是否與抗感染及抗炎作用相關也值得進一步思考。