建昌幫姜天麻中苯丙素類對(duì)小鼠抗暈眩作用的影響*

范暉 王麗華 劉琪琳 吳茜 張霞 簡(jiǎn)曉宇 葉喜德#

（1 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌330004；2 江西省高安市人民醫(yī)院藥劑科 高安330800）

天麻來(lái)源于蘭科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Bl.干燥塊莖，氣微，味甘，歸肝經(jīng)，可息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)[1]，主治肝陽(yáng)上亢、肝陽(yáng)化風(fēng)之眩暈頭痛、手足震顫、風(fēng)濕痹痛、小兒驚風(fēng)等。天麻主含天麻素、苯丙素類如β-苯丙烯酸（又名肉桂酸）、巴利森苷類等。天麻與鉤藤、羚羊角等藥對(duì)開(kāi)展研究較多[2]，很少涉及炮制。文獻(xiàn)也以天麻素和巴利森苷類成分研究較多[3]。對(duì)于苯丙素類[4]，目前文獻(xiàn)多為其分子結(jié)構(gòu)研究，未見(jiàn)針對(duì)天麻中該成分藥理作用的研究。苯丙素類如肉桂酸，可減少大鼠心肌缺血再灌注造成的損傷，起到保護(hù)心肌作用[5]。但該作用機(jī)理，對(duì)機(jī)體因心肌缺血狀態(tài)下的眩暈是否產(chǎn)生影響，仍需深入研究。為此，本研究旨在通過(guò)采用 Morris（Morris Water Maze）水迷宮實(shí)驗(yàn)方法[6]測(cè)試小鼠的逃避潛伏期及小鼠的平臺(tái)停留時(shí)間來(lái)探析姜天麻中苯丙素類對(duì)抗眩暈作用的影響。在歷版《中藥炮制學(xué)》教材中，天麻炮制的主要方法仍以清蒸后切薄片為主。雖然也有醫(yī)學(xué)典籍記載過(guò)酒制、醋制、刺蒺藜制等炮制法，但并未在臨床推廣應(yīng)用。2008年《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》和2011 年《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》載有姜天麻[7～8]，但未開(kāi)展現(xiàn)代研究。姜天麻為江西“建昌幫”特色炮制飲片，由于缺乏現(xiàn)代研究，致使其臨床應(yīng)用受限。中藥在應(yīng)用前必須進(jìn)行炮制，而炮制是通過(guò)使藥材成分變化而達(dá)到減毒增效目的。天麻除天麻素、巴利森苷類外，苯丙素類中肉桂酸也是其有效成分之一。顯然，天麻經(jīng)過(guò)姜制后，肉桂酸勢(shì)必會(huì)受到影響，但對(duì)該方面的報(bào)道仍處于空白。本研究從肉桂酸成分變化入手，結(jié)合藥效試驗(yàn)，探討炮制對(duì)其抗眩暈作用的影響，為天麻炮制后藥效增強(qiáng)提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料

1.1 儀器 OSB-2200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；HH-66 多功能數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；KQ5200 超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Morris 水迷宮硬件與視頻分析系統(tǒng)Xeye（V.3.2）（北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）；828L 福意聯(lián)恒溫冰箱（2～20℃，青海海爾股份有限公司）；CFXB30 蒸制容器（電飯鍋廉市博鴻電器廠)；cp214 電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；灌胃針、燒杯。

1.2 試藥 鹽酸地芬尼多片（國(guó)藥準(zhǔn)字H43020325）；β-苯丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：201903640，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；無(wú)水乙醇（AR）、生理鹽水、雙蒸水（實(shí)驗(yàn)室自制）、苦味酸（AR）。實(shí)驗(yàn)用天麻、生姜購(gòu)于江西省樟樹(shù)中藥材市場(chǎng)，天麻經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為蘭科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Bl.干燥塊莖。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠SPF 級(jí)100 只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SYXK（贛）2014-0008。飼養(yǎng)喂以無(wú)菌顆粒飼料，自由飲水，鼠房溫度（24±2）℃。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 動(dòng)物分組：取篩選后小鼠70 只，隨機(jī)分為七組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、姜提組、高丙組、中丙組、低丙組。采用苦味酸和標(biāo)簽紙等做好標(biāo)記。給藥：造模后，模型組灌胃給予各小鼠0.5 ml 生理鹽水溶液；陽(yáng)性對(duì)照組，按照6 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 鹽酸地芬尼多片溶液；姜提組灌胃給予0.5 ml 姜天麻提取物（濃度為1 g/ml）；高丙組按照9 mg/kg 用量灌胃給予 0.5 ml 肉桂酸溶液；中丙組按照6 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 肉桂酸溶液；低丙組按照3 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 肉桂酸溶液；空白組給予等量生理鹽水溶液。

2 方法

2.1 動(dòng)物篩選 小鼠于標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，采用自由攝食和飲水的方法，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，對(duì)各小鼠進(jìn)行Morris 試驗(yàn)，選擇逃避潛伏期約120 s 的小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，棄用靈活性過(guò)差，有視力障礙的小鼠，去掉不合格動(dòng)物，從中選擇合格小鼠70 只作為研究對(duì)象。

2.2 模型制備 采用水迷宮訓(xùn)練，2 次/d，總共訓(xùn)練7 d，除空白組外，其他各組小鼠采用物理眩暈法[9～10]，均于平衡旋轉(zhuǎn)儀上以350 r/min，旋轉(zhuǎn)1 min 驟停，立即將小鼠放入“電擊反射訓(xùn)練儀”電擊，潛伏期在30～250 min，較穩(wěn)定后用于后續(xù)研究。

2.3 藥物制備

2.3.1 姜天麻飲片粉末的制備 取天麻原藥材，依照“建昌幫”炮制法，置清蒸容器里，隔水加熱，使其受熱變軟，取出，取定量生姜搗汁，潤(rùn)透，使藥透水盡，于20～30℃烘箱中干燥，然后打成粉末，過(guò)60 目篩備用。

2.3.2 姜天麻提取物制備 稱取粉碎后姜天麻飲片粉末10 g，加入10 倍量70%乙醇浸潤(rùn)約30 min 后，置加熱容器里回流提取1 h，過(guò)濾，連續(xù)提取3 次，合并提取液，水浴鍋上濃縮至1 g/ml，待無(wú)醇味，備用。

2.3.3 其他藥物制備 陽(yáng)性對(duì)照藥物：取鹽酸地芬尼多片，溶解于生理鹽水中，制成濃度為0.4 mg/ml 的藥液備用。高劑量天麻肉桂酸溶液：取肉桂酸，溶解于生理鹽水中，制成濃度為0.6 mg/ml 的藥液備用。中、低劑量組分別為0.4 mg/ml、0.2 mg/ml 藥液，備用。

2.4 水迷宮訓(xùn)練與實(shí)驗(yàn) 各組試驗(yàn)小鼠于同一環(huán)境條件下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d（室溫：22～25℃，濕度50%～70%），自由飲食喂養(yǎng)隔日后，稱重。對(duì)不同組別的小鼠灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)7 d，從給藥后第1天開(kāi)始水迷宮訓(xùn)練，2 次/d，以建立小鼠對(duì)逃避電擊條件反射[11]。選取篩選后的健康小鼠，從f 點(diǎn)進(jìn)入水迷宮裝置內(nèi)，讓其尋找平臺(tái)E，在1 min 內(nèi)找到平臺(tái)的即為合格小鼠。未找到者，人為地將其引到平臺(tái)E，并讓其等待一段時(shí)間，如此一天訓(xùn)練2 次。訓(xùn)練結(jié)束后，灌胃給藥，并于1 h 內(nèi)放入水迷宮中以電刺激的方式強(qiáng)迫小鼠去找到平臺(tái)E，并記錄尋找平臺(tái)時(shí)間，即為逃避潛伏期。通過(guò)比較各組小鼠逃避潛伏期長(zhǎng)短來(lái)判斷天麻中肉桂酸的抗眩暈作用差異。除空白組外，其他各組小鼠均于平衡旋轉(zhuǎn)儀上以350 r/min，旋轉(zhuǎn)1 min 后立即從f 點(diǎn)下，采用物理眩暈法，待小鼠訓(xùn)練3 d 后，其水迷宮的成績(jī)大致趨于穩(wěn)定，遂以第4、5、6 天的平均成績(jī)?yōu)樽罱K逃避潛伏期。第7 天撤掉水迷宮平臺(tái)，并記錄各組小鼠在平臺(tái)位置停留時(shí)間。水迷宮實(shí)俯視簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖1。

圖1 水迷宮實(shí)俯視簡(jiǎn)圖

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩組間采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠逃避潛伏期比較 與空白組比較，模型組各組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，組間差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明造模成功；模型組逃避潛伏期較空白組延長(zhǎng)，差異顯著（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組、姜提組和高丙組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，差異顯著（P＜0.01）；與模型組相比較，低丙組逃避潛伏期稍有延長(zhǎng)和中丙組逃避潛伏期稍有縮短，但均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（）

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（）

注：與空白組相比較，*P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.01。

組別 n 劑量（mg/kg） 逃避潛伏期（s）空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組姜提組低丙組中丙組高丙組10 10 10 10 10 10 10--6 6 3 6 9 10.32±1.65 22.21±1.34*14.65±1.62#15.37±2.23#24.71±2.67 21.76±2.56 12.45±1.52#

3.2 各自小鼠平臺(tái)停留時(shí)間比較 與空白組比較，模型組各組小鼠平臺(tái)停留時(shí)間明顯縮短，差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明造模成功；模型組平臺(tái)停留時(shí)間與空白組比較，明顯縮短（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組、姜提組和高丙組平臺(tái)停留時(shí)間較模型組延長(zhǎng)，差異顯著（P＜0.01），低丙組和中丙組平臺(tái)停留時(shí)間較模型組稍有縮短，但均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各自小鼠平臺(tái)停留時(shí)間比較（）

表2 各自小鼠平臺(tái)停留時(shí)間比較（）

注：與空白組相比較，*P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.01。

組別 n 劑量（mg/kg） 平臺(tái)停留時(shí)間（s）空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組姜提組低丙組中丙組高丙組10 10 10 10 10 10 10--6 6 3 6 9 10.37±1.59 4.65±1.37*6.54±1.22#7.01±1.69#*4.29±1.12 3.99±1.03 7.56±1.38#

4 討論

苯丙素是一類含有苯環(huán)與三個(gè)直鏈碳連接（C6-C3基團(tuán)）結(jié)構(gòu)的化合物[12]，包括香豆素、木脂素等，一般具有苯酚結(jié)構(gòu)，是酚性物質(zhì)。苯丙素類化合物廣泛存在于植物中，其中許多化合物為親脂性成分。肉桂酸（Cinnnamic Acid）[13]化學(xué)名為3-苯基-2-丙烯酸或β-苯基丙烯酸，為苯丙素類化合物，具親脂性，也是天麻化學(xué)成分之一。肉桂酸常用于合成治療冠心病的重要藥物，如心痛平、肉桂苯哌嗪、乳酸可心定等，主要用于治療腦血栓、冠狀動(dòng)脈硬化、腦動(dòng)脈等疾病[14]。天麻常用于肝陽(yáng)上亢之頭目眩暈、頭痛，為治偏頭痛之要藥，而血管痙攣或動(dòng)脈血管硬化等常常是眩暈、偏頭痛發(fā)病的重要因素。建昌幫姜天麻以生姜為輔料炮制天麻，前期預(yù)試驗(yàn)表明，天麻經(jīng)姜汁制后，其所含的肉桂酸含量升高。同時(shí)，輔料生姜為辛溫之品，具有溫中散寒、祛風(fēng)止痛之效，而姜所含的化學(xué)成分如姜酮和姜烯酮等，能促進(jìn)血液循環(huán)，并對(duì)呼吸和血管運(yùn)動(dòng)中樞有興奮作用。生姜單用或與其他溫中散寒藥合用，可緩解眩暈和偏頭痛癥狀[15]。天麻經(jīng)姜制后可提高肉桂酸含量，并與生姜產(chǎn)生協(xié)同作用，這為本研究提供了理論基礎(chǔ)。

抗眩暈是天麻的主要藥效之一。采用水迷宮開(kāi)展中藥對(duì)抗眩暈研究[16]，主要是通過(guò)強(qiáng)迫動(dòng)物游泳或造模眩暈后的小鼠，讓其尋找平臺(tái)的一種試驗(yàn)方法。目的是測(cè)試受試小鼠對(duì)空間位置的學(xué)習(xí)記憶功能或抗眩暈作用。電擊復(fù)制小鼠眩暈?zāi)Ｐ蚚17]，是研究眩暈的一種常用方法。小鼠被電擊后出現(xiàn)眩暈癥狀，在這種狀況下，會(huì)造成小鼠短暫性學(xué)習(xí)記憶喪失。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過(guò)尋找平臺(tái)來(lái)比較不同組別小鼠的逃避潛伏期和尋找平臺(tái)時(shí)間，以判斷藥物對(duì)受試動(dòng)物的抗眩暈作用。該模型復(fù)制及相關(guān)試驗(yàn)，已應(yīng)用于天麻素抗眩暈作用研究[18]。天麻中肉桂酸、生育酚等苯丙素類成分[19]，雖有抗眩暈作用，但姜制后是否能使其藥效增強(qiáng)，仍需有待驗(yàn)證。基于此，本研究探討了天麻中的苯丙素類成分肉桂酸對(duì)抗眩暈作用的影響。結(jié)果表明，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、姜提組和高丙組，逃避潛伏期明顯縮短，組間差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明天麻經(jīng)姜制后，可提高天麻抗眩暈作用；而低丙組逃避潛伏期稍有延長(zhǎng)，以及中丙組逃避潛伏期稍有縮短，但兩者與模型組相比，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明天麻苯丙素類成分雖然對(duì)抗眩暈產(chǎn)生影響，但與其用量有關(guān)，其中高丙組抗眩暈作用明顯，該研究結(jié)果也與考察小鼠逃避潛伏期的結(jié)果一致，在低于一定劑量后抗眩暈作用減少。這種作用機(jī)理，可能是由于受試小鼠在通過(guò)一定程度量物理旋轉(zhuǎn)后，使其腦部血液循環(huán)發(fā)生障礙，導(dǎo)致一過(guò)性腦部供血不足，從而產(chǎn)生頭暈、眼花、腿軟、運(yùn)動(dòng)障礙等眩暈癥狀。但其分子作用機(jī)制，仍需有待研究。