基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對清肺排毒湯中射干-麻黃治療新型冠狀病毒肺炎的機制分析*

曾小艷童麗李永平#

（1青海大學2019級碩士研究生 西寧810016；2青海大學醫(yī)學院 西寧810099）

2019年12月我國湖北省武漢市報道多例由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-COV-2）感染引起的新型冠狀病肺炎（簡稱新冠肺炎，WHO正式命名為Coronavirus Disease 2019,COVID-19）。在我國抗擊新冠肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用，國家中醫(yī)藥管理局及國家衛(wèi)生健康委員會推薦使用清肺排毒湯[1]。射干麻黃湯是清肺排毒湯的重要組成部分，射干麻黃湯在新冠肺炎治療中發(fā)揮了宣降肺氣、溫肺化飲的作用，對新冠肺炎所致的咳喘發(fā)揮了重要作用。射干麻黃湯出自《金匱要略》，射干麻黃湯中射干-麻黃共為君藥，射干性味苦、寒，具有化痰止咳的功效；麻黃性味溫、辛、微苦，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘的功效[2]。在臨床中，射干與麻黃用于治療咳喘病癥時常配對使用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，射干具有抗氧化、抗炎等藥理作用[3]，麻黃具有抗氧化、平喘鎮(zhèn)咳等藥理作用。本研究對射干-麻黃治療COVID-19的有效活性成分、作用靶點、作用途徑進行分析。現(xiàn)報道如下：

1 分析方法

1.1 射干-麻黃活性成分及靶點篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）中檢索射干、麻黃，收集其化學成分以及靶點信息，設(shè)定成分篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18，對所有成分進行篩選，篩選出射干、麻黃的活性成分及作用靶點。

1.2 COVID-19靶點篩選 以“Novel Coronavirus”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫（OMIM）和美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因數(shù)據(jù)庫中進行檢索，篩選出疾病的靶點。

1.3 射干-麻黃治療COVID-19靶點的篩選 將射干、麻黃和新冠肺炎的靶點分別導(dǎo)入生物信息學與進化基因組學數(shù)據(jù)庫（Bioinformatics&Evolutionary Genomics）中，篩選出射干-麻黃作用于疾病的靶點，用于下面的通路富集分析。

1.4 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將射干-麻黃及COVID-19的共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap3.7.2中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以Degree、betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality這四個參數(shù)為參考標準，通過Degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，篩選出排名前20的靶點。

1.5 中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，以納入的射干-麻黃、對應(yīng)的活性成分、COVID-19及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，以篩選出核心活性成分。

1.6 GO富集分析 將射干-麻黃及COVID-19的共有靶點進行GO的生物過程（Biological Process,BP）、分子功能（Molecular Function,MF）、細胞組分（Cell Component,CC）富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，并用R3.6.3繪制柱狀圖及氣泡圖。

1.7 KEGG通路富集 將射干-麻黃及COVID-19共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，并篩選排名靠前的20條KEGG通路，應(yīng)用R3.6.3繪制柱狀圖及氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 射干-麻黃活性成分及靶點篩選結(jié)果 麻黃篩選得到23個有效活性成分和治療COVID-19的210個靶點；射干篩選獲得到17個活性成分和治療COVID-19的96個靶點。

2.2 COVID-19靶點基因篩選結(jié)果 經(jīng)過檢索，在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到2個疾病相關(guān)基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到350條相關(guān)基因，NCBI基因數(shù)據(jù)庫到51個基因，將這3個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后，得到356個新型冠狀病毒肺炎相關(guān)基因。

2.3 射干-麻黃治療COVID-19靶點篩選結(jié)果 將射干、麻黃和新冠肺炎的靶點分別導(dǎo)入Bioinformatics和Evolutionary Genomics數(shù)據(jù)庫中，篩選出射干-麻黃作用于疾病的靶點，治療COVID-19的靶點有48個，用于下面的通路富集分析。同時將射干-麻黃的靶點和疾病的靶點共同輸入Venny2.1.0繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 射干-麻黃治療新冠肺炎靶點圖

2.4 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果 將藥物疾病共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap3.7.2中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓 撲 分 析，以Degree、Betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality這四個參數(shù)為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，總共篩選出27個關(guān)鍵靶點，將前20個靶點使用R3.6.3進行圖片繪制。見圖2、圖3。從圖2、圖3中可以看出，射干-麻黃作用COVID-19的靶點蛋白主要有白細胞介素-6（IL-6）、CASP3、絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、白細胞介素-10（IL-10）、趨化因子2（CCL2）等蛋白。

圖2 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 射干-麻黃治療COVID-19的前20個靶點蛋白

2.5 中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，以納入的射干-麻黃、對應(yīng)的活性成分、COVID-19及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。以篩選出核心活性成分（77個節(jié)點，266條邊）。網(wǎng)絡(luò)圖中疾病及藥物成分的Degree值為：COVID-19為48、鼠李素41、異鼠李素29、射干10、麻黃18。網(wǎng)絡(luò)圖中各節(jié)點之間相連線路的數(shù)目為degree，該值越高說明該活性成分在射干-麻黃中起著越重要的作用，表明射干-麻黃治療COVID-19的主要活性成分可能為鼠李黃素41、異鼠李素29等。通過對網(wǎng)絡(luò)圖的分析，可以推斷出射干-麻黃中的活性成分可作用整個生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，表明射干-麻黃通過多靶點治療COVID-19。見圖4。

圖4 中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析 應(yīng)用R語言進行GO的生物過程、分子功能、細胞組分富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，并繪制柱狀圖。可以看出，射干-麻黃中的有效成分主要通過對脂多糖反應(yīng)、細菌源分子反應(yīng)，細胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)、細胞對細菌源分子反應(yīng)等生物過程作用于COVID-19。見圖5。

圖5 GO富集分析柱狀圖

2.7 KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，總共富集到150條信號通路，使用R3.6.3進行氣泡圖繪制。見圖6。隨著節(jié)點由小增大，節(jié)點富集到的靶點數(shù)量也逐漸增多，P值逐漸減小。從圖6中可以看出富集靶點較多的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、恰加斯病（美國錐蟲病）、利什曼病等通路。

圖6 KEGG通路富集柱狀圖

3 討論

在我國抗擊新冠肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用。新冠肺炎歸屬于中醫(yī)學“疫病”范疇，又稱瘟疫、疫癘，主要致病因素是“濕、毒”，濕毒化為濕熱可引起咽喉腫痛、咳嗽、咳痰，針對咳嗽、咳痰、咽痛等癥，清肺排毒湯中特意用到了射干、麻黃。

本研究通過篩選麻黃，得到23個有效活性成分和210個靶點，射干篩選獲得17個活性成分和96靶點。將兩者共有靶點刪除去重后，總共篩選出218個藥物靶點。其中治療COVID-19的主要活性成分為鼠李黃素41、異鼠李素29。據(jù)研究報道，鼠李黃素具有很好的抗炎作用及抗氧化作用，可以很好地預(yù)防肺部炎癥[4～6]，異鼠李素可通過抑制細胞炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1的釋放而發(fā)揮抗炎作用，同時異鼠李素具有調(diào)節(jié)免疫的作用[7]。

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選中，射干-麻黃作用COVID-19的靶點蛋白主要有IL-6、CASP3、MAPK3等靶點蛋白。Go富集分析中，射干-麻黃治療COVID-19的生物過程中起關(guān)鍵作用的主要有對脂多糖反應(yīng)、對細菌源分子反應(yīng)、細胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)、細胞對細菌源分子反應(yīng)等。有研究顯示[8～9]，脂多糖可通過活化炎性細胞釋放出大量的炎性因子，從而引起肺部的炎癥。通過KEGG通路富集可看出，射干-麻黃的靶點蛋白主要通過糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、恰加斯病（美國錐蟲病）、利什曼病等信號通路作用于COVID-19；AGEs-RAGE信號通路可通過激活NF-κB促進大量促炎細胞因子（如IL-6、IL-8）等的釋放，導(dǎo)致細胞和組織的炎癥損傷[10]。

綜上所述，射干-麻黃中的鼠李黃素、異鼠李素成分在治療COVID-19中起主要作用。射干-麻黃治療COVID-19的主要靶點蛋白是IL-6、CASP3、MAPK3、MAPK8、IL-10、CCL2等。射干-麻黃中的有效成分主要通過對脂多糖反應(yīng)、對細菌源分子反應(yīng)，細胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)、細胞對細菌源分子反應(yīng)等生物過程作用于COVID-19。射干-麻黃治療COVID-19的主要信號通路有AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、恰加斯病（美國錐蟲病）、利什曼病等。說明射干-麻黃治療COVID-19有多成分、多靶點、多途徑的特點。但網(wǎng)絡(luò)藥理學研究具有局限性，還需要后期進行動物實驗及從分子層面進行驗證，為射干-麻黃的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。