贛北工夫紅茶滋味特征及關鍵化合物分析

岳翠男，秦丹丹，蔡海蘭，王治會，李琛，李延升，楊普香*

1(江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌, 330202) 2(江西省茶葉質量與安全控制重點實驗室，江西 南昌, 330202)3(廣東省農業科學院茶葉研究所，廣東 廣州, 510640)

滋味是茶葉的重要感官屬性，影響茶葉滋味的化學組分多且存在復雜的交互影響[1-2]。食品風味術語是對產品感官性質的表達，其形成是通過經過訓練的評價組對代表性樣品的評價、討論而建立起來，能夠描述產品的風味特征、區別不同風味的產品[3-5]。贛北工夫紅茶包括寧紅和浮梁紅茶，以特殊的“蘋果香”和甜醇的滋味著稱，是中國最早的工夫紅茶之一，深受市場和消費者的青睞。當前，關于贛北工夫紅茶滋味表征和其滋味貢獻成分尚未見報道，因此，研究其分子感官基礎具有重要意義。

非靶向代謝組學研究對象是生物樣品中所有的內源性代謝物，采用理想的非靶向代謝組學樣品采集手段和制備方法可以盡可能多的提取出樣品的代謝物，且簡便快速[6-7]。近年來，越來越多的科學工作者將其應用到茶學研究領域，獲得有效的茶樹次生代謝規律以及不同茶類之間的差異代謝產物，便于人們了解茶葉內源性信息[8-10]。因此采用液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的非靶向代謝組學可以有效地檢測出茶葉中可以被人們感受到的滋味化學物質。定量描述分析(quantitative description analysis，QDA)是一種具備剖析、描述、定量功能的風味檢驗方法，其可以用簡單、大眾的詞匯描述樣品的感官印象，可單獨或綜合的應用于樣品的外觀、香氣、滋味與口感特征的評價[11-12]。前人采用QDA法構建了綠茶滋味、綠茶香氣、紅茶香氣、烏龍茶風味、滇紅風味的描述詞并對其強度進行評價，獲得相關茶類的風味特征，提高人們對茶葉品質的感官認知度[11，13]。

本研究以贛北工夫紅茶為研究對象，采用LC-MS和QDA分析樣品的非揮發性化合物以及滋味特征。擬對樣品滋味進行感官評價，鑒定其滋味化合物的構成，以非揮發性化合物含量為自變量，滋味感官分屬性強度為因變量，采用偏最小二乘-重要變量投影(partial least square-variable import project，PLS-VIP)進行統計分析，篩選出對滋味感官分屬性有重要貢獻的投影變量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料來自贛北不同廠家和不同等級的11份工夫紅茶樣品。其中編號1～8為寧紅，采購于修水縣，編號9～11為浮梁紅茶，采購于浮梁縣，樣品的加工采用傳統的工夫紅茶加工方法，包括鮮葉采摘、萎凋、揉捻、發酵、干燥、提香。每個樣品包裝采用統一規格的茶葉專用鋁箔袋，統一放在-4 ℃冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品非揮發性化合物檢測

實驗樣品處理：(1)稱取50 mg粉碎后的樣品于5 mL離心管，加入0.1 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸，0.1 mg/mL的Lyso PC17∶0，0.1 mg/mL的Cholesterol-3,4-13C2，0.1 mg/mL的Glycocholic acid-13C1各20 μL作為內標；(2)繼續向離心管中加入1 mL體積分數70%的甲醇水溶液，密封超聲提取30 min，-20 ℃靜置20 min，在13 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min；(3)將上清液轉入新的5 mL離心管中；重復操作步驟(2)2次，每一次獲得的提取液均移入(3)中的離心管，定容；(4)將獲得的提取液旋渦30 s，用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到LC進樣小瓶進行LC-MS分析，每個樣品3次重復。

液相色譜-質譜分析條件：采用Waters ACQUITY UPLC I-Class/VION IMS Qtof MS高分辨質譜儀組成的液質聯用系統。色譜柱為：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫45 ℃；流動相A：0.1%(體積分數)甲酸，流動相B：V(乙晴)∶V(甲醇)=2∶3(含0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；進樣量1 μL。流動相A的洗脫梯度為：0 min～1 min，99%～70%；1 min～2.5 min，70%～40%；2.5 min～6.5 min，40%～10%；6.5 min～8.5 min，10%～0%；8.5 min～10.7 min，0%～0%；10.7 min～10.8 min，0%～99%；10.8 min～13 min，99%～99%。質譜條件：離子源ESI；樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。毛細管電壓2.5 kV；進樣電壓40 V；碰撞電壓6 eV；離子源溫度115 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，脫溶劑氣流速900 L/h，質譜掃描范圍50～1 000 amu；掃描時間0.2 s；掃描間延遲0.02 s。

LC-MS定性：原始數據經代謝組學處理軟件Progenesis QI V2.3軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化?；衔锏蔫b定基于精確質量數、二級碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數據庫進行定性。LC-MS定量：采用峰面積歸一法。

1.2.2 茶樣感官評價

評價員篩選與描述詞產生：依據Herbert Stone建立的QDA理論體系，參與感官評價的人員必須具備一致、敏感、客觀及可控性[14-16]。因此，采用一般味覺篩選的三角試驗以及順位試驗進行評價員篩選，最終篩選出能分辨80%以上滋味的6名評茶員組成評價小組。稱取3.0 g干茶放入評茶杯中，注入150 mL沸水，5 min后瀝出茶湯，由建立的評價小組對樣品的滋味剖面進行初步描述，產生初步描繪詞。之后進行討論，再結合已有文獻所報道的工夫紅茶的風味描述詞和江西紅茶傳統風味特描述詞，刪除描述不清的和重復的詞匯，最終建立的描繪詞及定義見表1。

茶樣滋味感官評價：茶湯制備與上述相同，由評價小組按照建立的滋味描述詞及參比物進行評價，滋味描繪詞的感覺強度尺度為1～15，1～3為極微弱；3～5為微弱；5～7為弱；7～9為一般；9～11為較強；11～13為強；13～15為極強。結果取均值。

表1 贛北工夫紅茶滋味描述詞

1.3 數據統計與分析

采用SPSS 20.0進行描述統計、方差分析和相關分析；采用SIMCA14.1進行偏最小二-乘重要變量投影分析。

2 結果與分析

2.1 贛北工夫紅茶的滋味感官定量描述分析

2.1.1 樣品滋味分屬性強度的方差分析

樣品的9種滋味分屬性的強度評價結果見表2。從樣品各滋味分屬性平均值及方差分析可以看出贛北工夫紅茶的感官特征以甜、醇和回甘為主，各樣品的感官分屬性之間均有統計學差異?？?、澀、酸、甜、鮮是人類的基本味覺屬性，厚、醇、回甘等滋味分屬性是茶湯在口腔中的質構表征和味感持續效應[17]。QDA分析發現，茶湯的苦味、澀味、酸味及鮮味強度在“一般”及以下水平；樣品的甜味強度整體較高，只有11號樣的甜味和其他樣品間均存在顯著差異(P<0.05)；“厚”是茶湯內含物質在口腔中的綜合反映，茶湯厚度高，說明內含成分豐富[14]，本研究所選擇樣品的厚度存在顯著性差異(P<0.05)，推測原因是樣品之間的滋味成分差異性較大；“醇”是衡量茶湯滋味品質的重要指標，醇味強度的高低一定程度上可以反映消費者的喜好度，樣品的醇味強度為6.5～10.5，部分樣品間具有統計學差異，但整體較高，從側面說明了寧紅和浮梁紅茶市場接受性高的原因；異味產生多因加工工藝不當、加工環境不夠潔凈、貯存不當等，本研究所抽取樣品的異味均在極微弱水平。

表2 贛北工夫紅茶滋味感官定量描述分析結果

2.1.2 樣品滋味分屬性強度的相關性分析

采用相關性分析法探究茶湯滋味分屬性之間的相關性，結果見表3。贛北工夫紅茶的整體滋味強度與異味、苦味分別呈極顯著、顯著負相關，與酸味、澀味呈負相關，但未達到顯著水平；其與甜味和醇味分別呈極顯著和顯著正相關，回甘、鮮味、厚味也與茶湯的整體滋味品質呈正相關，但未達到顯著水平。滋味分屬性之間也存在顯著相關性，茶湯的苦味和澀味呈顯著正相關，與甜味呈顯著負相關，有研究表明澀味和苦味兩者之間具有明顯的加和效應[15]；甜味與異味之間具有極顯著負相關；鮮味與回甘之間具有極顯著正相關，這兩者均與整體滋味強度呈正相關。

表3 各滋味分屬性的相關性分析

2.2 贛北工夫紅茶的非揮發性成分分析

對贛北工夫紅茶樣品進行LC-MS檢測分析，其分析結果見圖1，紅色代表化合物在茶樣中含量高于平均值，綠色代表化合物在茶樣中含量低于平均值，顏色深淺代表含量高低程度。主要檢測到的共有非揮發性化合物74種，包括25種酚類、23種氨基酸類、9種色素類、9種有機酸類、5種糖類、2種生物堿和茶皂素，酚類包括兒茶素類、黃酮醇類和黃酮苷類，氨基酸為不同類型的氨基酸單體和復合氨基酸，色素類分為茶黃素類、花色素類和花青素類；糖類包括單糖、二糖和三糖；生物堿包括咖啡堿和可可堿。從熱圖顏色深淺上可以看出，每一種化合物在11份工夫紅茶中含量均有差異，未發現顏色完全一致的成分，此結果也從側面說明了茶樣各感官分屬性均有統計學差異的原因。

圖1 主要非揮發性成分熱圖分析

2.3 贛北工夫紅茶滋味特征關鍵貢獻化合物篩選

PLS-VIP可以對龐大的數據系統進行分解和降維，從復雜的數據變量中識別出對因變量影響較大的自變量，且可以有效地避免自變量之間多重共線性的干擾[17-18]。以非揮發性化合物為自變量X，滋味感官分屬性為因變量Y，進行PLS-VIP分析。樣品在前2個主成分上的分布結果見圖2。

圖2 樣品在主成分上的分布

PLS提取出3個主成分，對模型的總解釋度為72.1%，11個樣品中7、8號樣品以及4、6號樣品存在重疊，原因7、8號和4、6號樣品源于同一生產廠家，所使用茶樹品種以及鮮葉等級一致，其他各樣品可以在主成分上有效的區分開來，說明模型的可信度較高，可以進行下一步的PLS分析。滋味分屬性與主要非揮發性成分的關聯圖見圖3。

圖3中的非揮發性成分對滋味分屬性的VIP值>1時，即說明其為贛北工夫紅茶滋味的關鍵貢獻成分，其中共有33種化合物的VIP值>1，包括10種氨基酸類、12種酚類、3種色素類、1種生物堿、4種酸類、3種糖類。分別是L-組氨酸、富馬酸、咖啡堿、L-天冬酰胺、異麥芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黃素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎寧酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黃素 3-沒食子酸酯、表兒茶素(epicathchin，EC)、飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天門冬氨酸、兒茶素沒食子酸(catechin gallate，CG)、沒食子兒茶素沒食子酸(gallocatechin gallate，GCG)、山奈素3-O-鼠李糖苷、沒食子兒茶素(gllocatechin，GC)、楊梅素、沒食子酸(gallic acid，GA)、檸檬酸、茶黃素、L-焦谷氨酸、L-蘇氨酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。說明此33種非揮發性成分為贛北工夫紅茶滋味的關鍵貢獻成分。

2.4 各滋味分屬性關鍵貢獻化合物篩選

為進一步探討每個滋味分屬性的關鍵貢獻成分，以各滋味分屬性強度為因變量Y和主要非揮發性化合物為自變量X進行PLS-VIP分析，得到對8個滋味分屬性具有重要貢獻的化合物，因異味PLS解釋度較差，對異味具有重要貢獻的物質需進一步結合香氣成分進行討論，VIP值>1的成分篩選結果見表4。

苦味-VIP：對苦味有重要貢獻的化合物有14種，包括2種氨基酸類、3種多酚類、4種色素類、2種生物堿、2種酸類、1種糖類和茶皂素；對苦味影響最大的為咖啡堿，其次為可可堿，兩者的的VIP值分別為4.17和3.59，遠高于其他化合物的VIP值，從呈味特性來看，咖啡堿和可可堿均為苦味，相關研究已表明，咖啡堿與苦味有顯著的正相關[19]；4種色素類化合物主要是茶黃素類，其可以和咖啡堿絡合從而改善茶湯的風味[15]，3種酚類物質均屬于黃酮苷類化合物，通常在口腔里表現為澀味，可以加強味覺和大腦對苦味的感知，繼而增強茶湯的苦味；茶皂素具有辛辣的苦味，會抑制茶湯的甜味[20]。

澀味-VIP：對澀味有重要貢獻的化合物有27種，包括10種氨基酸、9種酚類、5種酸類、1種生物堿類、1種色素類、1種糖類。對澀味影響較大的化合物為具有澀味的酚類和苦味氨基酸類化合物，以及呈酸味的草酸和呈苦味的L-異亮氨酸、L-酪氨酸；多酚類中EGCG閾值較低，屬于含量最高的兒茶素，被認為是對綠茶澀味貢獻最大的兒茶素[15]，而在澀味PLS-VIP分析中，EGCG的貢獻不大，可能是由于贛北工夫紅茶中的EGCG氧化較為充分。

鮮味-VIP：鮮味具有味覺平衡風味增強作用[21]。影響茶湯鮮味的關鍵化合物有27種，包括10種酚類、7種氨基酸類、4種色素類、2種酸類、2種生物堿、2種糖類，對鮮味影響較大化合物為L-谷氨酸、L-精氨酸、異麥芽糖、和紫云英苷，本研究中工夫紅茶的鮮味處于“弱”強度水平，推測可能是由于L-谷氨酸的滋味被呈澀味的酚類化合物削弱而引起的；投影到鮮味的化合物種類較多為呈澀味的多酚類物質，口腔中澀味的存在對鮮味具有抑制效應。

酸味-VIP：對酸味有關鍵影響的滋味化合物有33種，包括8種氨基酸類、11種酚類、5種色素類、7種酸類、2種糖類，對酸味影響較大的是天冬酰胺、芹菜素和莽草酸等。7種酸類對酸味的VIP值為1.01～1.50，對酸味有貢獻的化合物呈味特性主要為酸味、甜味和澀味，說明這幾種滋味之間可能存在交互效應，相關性分析結果也顯示澀味、苦味與酸味之間呈正相關，甜味、鮮味與酸味呈負相關。樣品的酸味整體強度較低，可能是由于贛北工夫紅茶的甜味強度高，抑制了酸味在味蕾上的表達。

甜味-VIP：甜味是贛北工夫紅茶優異品質的重要表現。影響茶湯甜味的化合物主有19種，包括8種氨基酸類、6種酚類、3種糖類、1種酸類、1種色素類，對甜味影響較大的為D-葡萄糖、山奈素-3-O-鼠李糖苷和山奈酚等，后兩者屬于黃酮苷類，而該類物質多表現為澀味，且在高濃度條件下，還可以增強茶湯的苦味[22-23]，因此，在茶葉加工過程中應減少黃酮苷類化合物的積累，還需通過一定工藝處理，促進多糖類和糖苷化合物水解為單糖、二糖等可溶性糖類化合物，提高茶湯的甜度。

回甘-VIP：回甘是多種滋味分屬性的綜合效應[15]。對回甘有關鍵影響的化合物有30種，包括6種氨基酸類、13種多酚類、4種色素類、4種酸類、2種糖類、1種生物堿，其中異麥芽糖、原花青素、紫云英苷影響較大，有研究表明，澀感是回甘的關鍵貢獻分屬性之一，前面相關性分析結果表明，回甘與苦味、澀味以及酸味呈負相關，與鮮味、甜味呈顯著的正相關，表明具有甜味和鮮味的化合物對回甘有正效應，呈苦味、澀味、酸味的化合物對回甘有負效應，然而，在PLS-VIP結果中，VIP值>1多為呈澀味、苦味和酸味的化合物，呈甜味或鮮味的化合物只有L-組氨酸、異麥芽糖和D-葡萄糖，從側面說明了樣品的整體回甘強度較弱的原因。

醇味-VIP：醇味是滋味化合物之間互作效應協調的表現[17]。對醇味有重要影響的化合物有20種，包括8種氨基酸類、茶皂素、3種酚類、1種色素、1種生物堿、5種酸類、1種糖類，其中貢獻較大的為L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸，VIP>1的化合物以呈鮮味、甜味、酸味為主，從化合物種類來看，糖類化合物對醇味的影響較小。

厚味-VIP：對厚味有重要貢獻的化合物有34種，包括16種氨基酸、7種酚類、3種色素、5種酸類、2種糖類和茶皂素，貢獻較大的為草酸、谷氨酰胺、L-蘋果酸，此3種化合物均帶有酸味，且所檢測到的酸類化合物中，有50%以上與厚味密切相關，因此，推測酸類化合物對“厚”的影響極大，然而，在滋味分屬性相關性分析中，酸味與厚味之間并沒有明顯的相關性，目前，本研究未能對這2種相悖的結論做出有價值的解釋，需要進一步的研究。

3 結論

獲得了贛北工夫紅茶的9個滋味描繪詞及定義，其滋味特征以甜味、醇味和回甘為主，各樣品的滋味分屬性之間存在統計學差異，且滋味分屬性之間存在復雜的相關性。共篩選到74種共有非揮發性化合物，包括25種酚類、23種氨基酸類、9種色素類、9種有機酸類、5種糖類、2種生物堿和茶皂素；其中有33種化合物對贛北工夫紅茶滋味具有重要貢獻，分別為L-組氨酸、富馬酸、咖啡堿、L-天冬酰胺、異麥芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黃素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎寧酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黃素-3′-沒食子酸酯、EC、飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天門冬氨酸、CG、GCG、山奈素3-O-鼠李糖苷、GC、楊梅素、GA、檸檬酸、茶黃素、L-焦谷氨酸、L-蘇氨酸和EGCG，并進一步得到了對各滋味分屬性具有重要貢獻的化合物。