多重聚合酶鏈式反應技術在食源性致病菌檢測上的應用研究進展

張明娟，王娟，袁磊，肖昭競，龍梅，李根容

(重慶市計量質量檢測研究院，重慶，400020)

食品是人類賴以生存和發展的物質基礎，食品安全是關乎人民健康與國計民生的重大問題，近年來，由食源性致病微生物引起的食物中毒已經成為了全球共同關注的食品安全問題，根據世界衛生組織提供的數據，全球食源性疾病患者總人數數以億計，平均每年都會發生上億的腹瀉病例，超過300萬的5歲以下兒童因此喪命，其中超過70%的腹瀉是由生物源性污染食品造成[1]。因此，加強食品中致病微生物監測，以應對食品安全突發事件，已成為各國政府和國際相關組織所面臨的迫切任務。

1 我國現行食源性致病菌檢測方法

目前，我國開展食源性致病菌檢測主要依靠傳統的培養法，包括細菌培養、血清學、生化鑒定等過程，依據標準主要是GB 4789系列[2-19]和GB 8538[20]。傳統培養法檢測受微生物生長情況影響較大，并且其檢測周期長，一般需要4～7 d，操作也繁瑣復雜，十分耗時耗力，已不能滿足我國公共衛生突發事件應急檢測的需要。

近年來，分子生物學技術發展十分迅速，致病菌檢測標準在制定中從傳統的培養方法逐漸轉變為分子生物學方法，查閱目前現行標準，在致病菌檢測中主要利用的分子生物學技術為傳統聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術[4，10]、實時熒光定量PCR技術[18，21-22]、環介導恒溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術[23-24]、數字微滴PCR技術[25]、飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight，MALDI-TOF)技術[26]等，具體如表1所示。

分析其標準類別，發現使用分子生物學技術標準基本都是行業標準、地方標準，而使用范圍最廣的國家強制性標準GB 4789和GB 8538，還是以傳統培養方法為主，僅在2017年實施的GB 4789.6—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》、GB 4789.12—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》中用到傳統PCR技術，GB 4789.42—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》中用到實時熒光定量PCR技術。這主要是由于實時熒光定量PCR技術、數字微滴PCR技術、MALDI-TOF技術對實驗室人員、儀器要求較高，檢測成本也較高，限制了其在實驗室大范圍普及使用，而LAMP技術雖對儀器要求較低，但引物設計較為困難，往往需要設計幾對GC含量合適，打分較高的優質引物組，在序列條件不是特別好的情況下，較難實現，大范圍使用也存在困難。強制性標準中目前僅有GB 4789.42—2016利用實時熒光定量PCR技術，主要是因為病毒檢測對實驗室能力要求較高，具有這一能力的實驗室在人員、儀器配置上本來就處于國內較高水平。而傳統PCR技術相比于熒光定量PCR、數字微滴PCR等技術，操作簡單，檢測成本也較低，這也是近年來國家強制性標準逐漸使用這一技術的原因。

表1 利用分子生物學方法原理的部分標準

傳統PCR技術又可分為多重PCR技術與常規PCR技術，與常規PCR技術相比，多重PCR技術同時選擇多個高度保守的基因序列設計引物進行擴增，可提高特異性減少假陽性，由于加入多對特異性引物，即可同時在一個反應體系中擴增出多條目的 DNA 片段，實現了一次性檢測多個基因的目的，可大大節省時間、費用成本，從而在檢測應用上具有很好的發展前景。

2 多重PCR技術原理

多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是在常規 PCR基礎上發展起來的，其反應原理、反應試劑和操作過程與常規 PCR相同，通過模板 DNA 與引物之間的變性、退火和延伸3個步驟為1個循環，每次循環產生的DNA 片段為下次循環的模板[27]，區別在于多重PCR技術在同一個反應體系中加入2對或2對以上引物，分別擴增不同的模板，得到不同的目的片段。

從1988年CHAMBERLIAN等[28]首次提出多重PCR至今，其已廣泛應用于多個領域，如臨床混合感染的鑒別[29]、病毒檢測[30]、病原微生物檢測[31]、微生物耐藥性檢測[32]等。

3 多重PCR技術在食源性致病菌檢測中的應用現狀

目前，多重PCR在食源性致病菌檢測的應用上主要分為兩個方面：同時檢測單一致病菌的不同基因和同時檢測不同致病菌基因。

3.1 同時檢測單一致病菌不同基因的應用

單一致病菌的檢測主要是對于一些血清型比較復雜或者具有多個毒力基因的致病菌，如沙門氏菌屬、產氣莢膜梭菌、志賀氏菌屬、阪崎腸桿菌等。

由于沙門氏菌屬具有多種血清型，若僅用單對引物對沙門氏菌進行檢測，往往不夠準確，LIM等[33]利用多重PCR技術，用鼠傷寒沙門氏菌的rfbJ、fljC、fljB基因設計3對特異引物對鼠傷寒沙門氏菌進行 PCR 擴增，結果表明僅有鼠傷寒沙門氏菌出現擴增條帶，其他的沙門氏菌型和非沙門氏菌均未檢出，3對引物和PCR體系對鼠傷寒沙門氏菌具有很好的特異性。

產氣莢膜梭菌可以分為5型，分別具有不同的毒素組合，用單一的引物對很難避免漏檢情況，李偉杰等[34]利用產氣夾莫菌α、β、ε和ι毒素基因設計并合成4對特異性引物，通過PCR體系優化，建立了一種快速鑒定產氣莢膜梭菌毒素型的多重PCR方法，產氣莢膜梭菌A、B、C、D和 E型參考菌株均擴增出相應條帶，而其他菌均未擴增出條帶，該方法對產氣莢膜梭菌檢測研究具有很好的參考價值。

為提高志賀氏菌耐藥性和毒性檢測的時效，王倩等[35]根據福氏志賀菌耐藥性基因gyrA，parC及毒力致病性基因ipaH，分別設計了3對引物，實現了對福氏志賀菌喹諾酮耐藥決定區基因、毒力基因的同時檢測。

樓秀芹等[36]分別以阪崎腸桿菌ITS序列、16S rDNA和ompA基因為靶基因，選擇3對引物，對阪崎腸桿菌進行多重PCR檢測，檢測靈敏度和特異性均能達到國標方法，但與國標方法相比，極大節約檢驗時間。黎明等[37]以阪崎腸桿菌基因組16SrRNA-23rRNA的內部轉錄間隔區(ITS)基因和外膜蛋白A(ompA)基因為靶標選擇引物，進行雙重PCR擴增，該研究結果顯示，所建立的體系可用于食品中阪崎腸桿菌的檢測。

目前利用多重PCR技術檢測單一致病菌的現行標準查閱到2個：SN/T 2565—2010 《食品中志賀氏菌分群檢測 MPCR-DHPLC法》，該標準利用志賀氏菌的ipaH、prpB、wzzB、SHT基因設計了1對志賀氏菌屬的特異引物和4對志賀氏菌不同血清種的引物，在利用變性高效液相色譜分析法對PCR產物進行檢測，可同時達到檢測志賀氏菌屬和區分志賀氏菌屬中的福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌的目的。SN/T 4603—2016《出口食品及水體中產毒副溶血性弧菌常見致病基因檢測方法 多重PCR及多重實時熒光PCR法》中第一法利用副溶血性弧菌的gyrase、tdh和trh致病基因設計引物，根據特異擴增條帶的有無，判定樣品中是否含有副溶血性弧菌及產毒副溶血性弧菌。

3.2 同時檢測不同致病菌基因的應用

同時檢測不同致病菌基因在食源性致病菌檢測上應用也較多，陳偉[38]通過設計6對特異性引物、DNA 提取方法優化、退火溫度和 Mg2+濃度等PCR主要反應條件優化，分別建立了沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌O157：H7和單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的2個多重PCR檢測體系，其特異性和靈敏度較高，靈敏度達到皮克(pg)級。郭倩倩[39]根據沙門氏菌invA、單核細胞增生李斯特菌的iap、金黃色葡萄球菌的nuc和副溶血性弧菌的tdh分別設計4對特異性引物，獲得了水產品中致病菌的多重 PCR 檢測。李聰等[31]以蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌gyrB、nuc、ipaHIII、SiiA設計的4個引物對，建立了多重PCR方法，該方法具有良好的特異性和靈敏性，可應用于食品中蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的檢測。

目前利用多重PCR技術同時檢測不同致病菌基因的現行標準有DB22/T 1828—2013《農產品中沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測》，DB22/T 1676—2012《凍鮮魷魚多種致病菌的測定 多重PCR法》，以及2020年7月1日實施的SN/T 5225—2019《進出口食品中五種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法 多重PCR法》，該標準規定了進出口食品中腸致病性大腸埃希氏菌(EnteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)，腸出血性大腸埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC，又稱產志賀毒素大腸埃希氏菌)，腸產毒性大腸埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli,ETEC)，腸侵襲性大腸埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)，腸集聚性大腸埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)5種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法。

3.3 多重PCR技術商業化應用

一些科研機構和公司也在開發多種食源性致病菌PCR檢測試劑盒，這些試劑盒的使用，可以大大提高食源性致病菌檢測效率。其中使用較多的有5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒是根據GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》設計，并在標準中允許使用的商品化試劑盒，該種試劑盒中包含的5種致瀉性大腸桿菌(EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC)含有11種毒力基因，針對這11種毒力基因，設計11對特異引物，與樣本中基因組的相應靶位點特異性結合，PCR反應后，不同類型的樣本產生不同的擴增片段，從而達到對5種致瀉性大腸桿菌快速分型檢測的目的，該試劑盒也與上文中提及的SN/T 5225—2019 《進出口食品中五種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法 多重PCR法》標準原理一致。

另外，還有針對克羅諾桿菌屬檢測的試劑盒研究，周楊等[40]通過篩選獲取克羅諾桿菌的16SrDNA和ompA基因的保守序列，開發了食品中克羅諾桿菌屬雙重PCR檢測試劑盒，實驗表明該試劑盒滿足各項性能需求，便于對食品中克羅諾桿菌的快速檢測。

在專利申請上，南京美寧康誠生物科技有限公司[41]公開發明專利《11種腸道致病菌核酸多重PCR檢測試劑盒及其應用》，該專利包括11種腸道致病菌的引物，有霍亂弧菌O1群、霍亂弧菌O139群、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸黏附性大腸埃希氏菌(EAEC)、產毒素大腸埃希氏菌(ETEC)和大腸埃希菌O157:H7的引物，該專利的方法可直接應用于腦炎病原體樣本進行檢測。北京卓誠惠生生物科技有限公司[42]公開發明專利《十四種食源性致病菌多重PCR檢測引物組和試劑盒》，該專利試劑盒包含了沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生性李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、霍亂弧菌、大腸埃希氏菌O157、嗜水氣單胞菌和陽性內對照的引物對。

4 多重PCR檢測應用的技術要點

綜上，多重PCR技術具有通量高，節省時間和成本的優點，其研究較多，但在各檢驗機構實際開展檢測的應用并不多，僅查閱到5個相關的標準，商業化應用也較少，目前僅有5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒應用較好，雖有相關的專利申請，但真正用于市場上銷售，檢驗機構可以使用的試劑盒也不多，這主要是由于多重PCR檢測中存在以下技術難點：(1)PCR體系和PCR條件比常規PCR較嚴苛，需要不斷摸索和優化，多重PCR體系實驗穩定性還有待提高；(2)多重PCR體系中同時存在多對引物和多種DNA模板，引物和引物之間，引物和模板之間容易互相干擾，如果引物設計不當、PCR體系中各種物質濃度選擇不當、PCR條件不合適等因素中有一個不合適，都可以引起擴增失敗或者特異性、靈敏度降低，出現非特異性產物。

因此，在應用多重PCR技術時，必須有嚴密的實驗計劃，首先從引物設計開始，就必須考慮引物之間的干擾、互補，PCR產物條帶大小，各對引物的退火溫度差異等問題；其次是PCR體系優化，其中引物濃度、DNA模板濃度、Mg2+濃度等重要影響因素需有適合的實驗方案來進行優化；最后PCR條件中的退火溫度也需要不斷進行實驗優化。

5 前景與展望

多重 PCR 技術的應用雖然受到技術難點的制約，但其在食源性致病菌檢測中具有的高通量性、成本節約性優勢，在實際檢測中具有很好的發展前景，結合現有的研究基礎，多重PCR技術未來的研究可主要集中在以下幾個方面：(1)多重PCR技術在食源性致病菌檢測時，一般需要12～24 h的前增菌，這一步嚴重影響了多重PCR檢測效率，因此后期研究中可以結合目標菌的富集技術，以提高檢測效率，如有研究者開始研究磁珠富集[43]和雙抗體富集技術[44]等；(2)在實際檢測中，應不斷增加多重PCR體系中引物對數量，以達到更高的檢測通量，并加強研究與食源性致病菌檢測標準或國家抽檢要求相一致的菌種，以提高多重PCR技術在實際檢測中的應用；(3)隨著多重PCR體系中引物對的增加，PCR產物條帶數的不斷增加，為后續產物分離帶來了難點，因此多重PCR技術也可以結合除電泳技術以外的產物分離檢測技術，如結合現有發展比較成熟的液相、液質技術等。