抗氧化肽的研究現狀

張強，李偉華

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽，233100)

人體細胞在代謝過程中會產生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，機體的抗氧化防御系統可以有效地清除這些ROS，即正常情況下，ROS的產生和消除處于一種微妙的平衡狀態[1]。當ROS產生過多或機體抗氧化防御系統失效時，這種平衡就會被打破，機體將處于氧化應激狀態[2]。由過量ROS引起的氧化應激會破壞細胞的氧化還原穩態，誘導細胞自噬，引發細胞凋亡，并引起不可逆的組織損傷[3]。已經證實，氧化應激引起的損害可導致癌癥、糖尿病、炎癥、心血管疾病、哮喘以及阿爾茨海默病等多種慢性疾病[4-6]。此外，ROS在食品加工和貯存過程中也發揮著重要作用，它會導致食品酸敗、異味、質地退化、營養價值降低，進而給人們帶來經濟損失和健康風險[7]。因此，需要更多的關注如何增強組織和細胞對ROS的防御以及如何延緩食品在加工和貯藏過程中的氧化變質。

抗氧化劑在減輕機體的氧化損傷以及預防食品的氧化變質方面起著非常重要的作用。雖然合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、沒食子酸丙酯、丁基羥基甲苯和叔丁基氫醌等，具有高效和價格低廉的優點，但是其潛在的毒性和致癌性導致其在食品工業中的應用受到限制，所以，人們將更多的注意力集中于天然抗氧化劑上[6]。抗氧化肽是近年來被廣泛研究的一類天然生物活性肽。抗氧化肽作為一種天然抗氧化劑，其結構相對簡單、易吸收、穩定性好、無免疫反應性，不僅具有較強的抗氧化活性，還具有降血壓和抗癌等其他保健功效，在食品和醫療保健品領域越來越受到人們的關注[4, 6, 8]。在Web of Science數據庫中以“抗氧化肽”(antioxidant peptide或antioxidative peptide)作為檢索詞進行標題檢索，結果顯示，2000—2020年，國內外學者累計發表了3 089篇抗氧化肽的相關文章，且文獻的數量呈現逐年增加的趨勢。截至2020年6月，已有652個長度在2～30個殘基的抗氧化肽序列被存入BIOPEP數據庫[9]。綜上表明，抗氧化肽是一個非常重要的科學研究領域。因此本文綜述了近年來抗氧化肽的相關研究進展，分析和總結了抗氧化肽在研究和開發過程中存在的具體問題，并對其未來的開發應用前景進行了展望，旨在為抗氧化肽的深度開發利用提供參考。

1 抗氧化肽的制備

目前，抗氧化肽的制備途徑主要有3種：(1)直接從生物體中分離提取內源性抗氧化肽；(2)通過蛋白酶酶解、酸水解或發酵法降解可食性蛋白質制備抗氧化肽；(3)通過化學反應或DNA重組手段人工合成抗氧化肽。在這些方法中，酶解法因具有條件溫和、易于控制、專一性較強、副產物少、安全性高和易于推廣等優點，研究得最多[10-11]。動物和植物蛋白是酶解法生產抗氧化肽的重要原料來源。當前，植物性蛋白的原料主要有大豆、玉米、小麥、花生、水稻和菜籽等，其中作為糧食的大豆、玉米和小麥及其加工的附產品研究得較多，也較為深入；動物性蛋白原料以乳蛋白居多，其次是肉類蛋白。乳蛋白包括全乳、乳清蛋白和乳酪蛋白等，而肉蛋白以魚類加工的副產品居多。除了動物和植物蛋白，近年來以食用菌分離蛋白為原料制備抗氧化肽的研究也越來越多，如源自阿魏菇[12]、元蘑[13]和雙孢菇[14]等食用菌蛋白的抗氧化肽均有報道。風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶等各種商用蛋白酶是抗氧化肽制備經常使用的水解酶[15]。這些酶可以單獨作用，也可聯合作用。在一些研究中，用胃蛋白酶-胰蛋白酶的連續水解模擬人體的胃腸道消化來生產抗氧化肽[16]。表1給出了近年來酶解法制備抗氧化肽的一些實例，這些研究成功地從多種不同原料蛋白中制備出具有較強活性的抗氧化肽。從這些文獻報道可知，酶解過程中，所使用蛋白酶的種類直接影響著所得抗氧化肽的大小、組成以及氨基酸順序，并最終影響其抗氧化活性。另外，反應時間、溫度、pH、酶/底物比例等催化反應條件也會對抗氧化肽的活性產生重要影響。

表1 酶解法制備抗氧化肽實例

2 抗氧化肽的分離純化與結構鑒定

分離純化是抗氧化肽研究開發的重要環節。抗氧化肽分離純化與結構鑒定的操作程序一般如圖1所示[22]。原料蛋白經過酶法水解后，產物一般是蛋白質、肽及氨基酸的混合物，而且混合物中的各種小肽分子大多分子質量相近、親水性和疏水性也相似，分離純化比較困難。當前對抗氧化肽的分離和純化主要基于它們的理化特性，例如分子質量大小、電荷、極性、溶解度以及特定的共價或非共價相互作用等。現有的研究中，一般采用多種分離純化方法相結合的方式獲得目標抗氧化肽。常采用的分離純化方式有超濾、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析和反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HLPC)等。

圖1 抗氧化肽的分離純化與結構鑒定流程

結構鑒定是開發新型抗氧化肽的必要步驟。目前常用的抗氧化肽結構鑒定方法有蛋白質/肽序列分析儀法、質譜法(mass spectrometry, MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)等。蛋白質/肽序列分析儀對樣品純度要求非常高，且在有些情況下會遇到困難，如N端有封頭，肽鏈中有改性氨基酸以及肽的疏水性很強等都會使測定無法進行或者發生錯誤，一般認為該法在30步內比較可靠[23]。質譜法具有高靈敏度和高效率等優點，使之適用于肽類物質的一級結構檢測。可用于抗氧化肽結構鑒定的質譜方法有快原子轟擊質譜、電噴霧電離質譜(electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS)和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜[24]。質譜法與高效液相色譜的聯用技術使抗氧化肽的結構鑒定更加高效。當前，液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS)已廣泛用于肽類物質一級結構的鑒定。核磁共振由于圖譜信號的純數字化、范圍過寬、過度的重疊、核信號弱和圖譜分辨率低等原因，在抗氧化肽的結構鑒定中應用不多。相信隨著二維、三維以及四維NMR的應用，以及分子生物學、計算機處理技術的發展，NMR也有望在肽類物質的分析鑒定中得到越來越廣泛的應用[23]。

表2總結了近兩年來國內外科研人員已分離和鑒定的部分抗氧化肽。由表2可知，當前國內外的很多實驗室都在優選抗氧化肽的分離純化方法，有越來越多的抗氧化肽被分離和鑒定出來，但普遍存在分離過程繁雜、儀器昂貴、成本較高、產率較低、普適性差以及難以實現工業化等問題。

表2 2019—2020年分離鑒定的抗氧化肽精選

抗氧化肽的抗氧化活性與其分子質量大小、疏水性以及氨基酸組成和序列密切相關。分子質量較小的肽通常比分子質量大的肽具有更強的抗氧化活性，因為它們更易于與目標自由基相互作用，終止連鎖反應，大多數抗氧化肽的分子質量為500～1 800 Da[30, 33]。疏水性是影響肽的抗氧化活性的關鍵因素之一，色氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸等疏水性氨基酸殘基能夠促進肽在脂質-水界面處的溶解，從而更好地發揮清除自由基的作用[15, 31]。特別是亮氨酸或纈氨酸位于N-末端時，肽的抗氧化活性通常更強[34]。芳香性氨基酸也對肽的抗氧化活性具有重要影響，因為色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸殘基中的芳香族基團可以通過提供氫質子來清除自由基[30]。另外，資料表明，酸性或堿性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸等對肽的抗氧化活性起著重要作用，這些氨基酸殘基所帶的電荷直接決定著肽對金屬離子(如Fe2+和Cu2+)的螯合能力[16, 35]。總之，較低的分子質量、特定氨基酸殘基的疏水性、供氫體作用以及螯合金屬離子作用可能是抗氧化肽具有較強抗氧化活性的重要原因。

3 抗氧化肽的分子修飾

酶解法水解底物蛋白制備的抗氧化肽，其抗氧化活性必定受原料蛋白一級結構的限制，因此，為進一步提高抗氧化肽的生物學效用，有必要對其結構作進一步的修飾處理。分子修飾的目的是為了延長和提高抗氧化肽在目標靶位的生物活性。對肽類進行分子修飾，即在其氨基酸序列上偶合糖類、脂類、微量元素等修飾基團，可將修飾基團的優良性質(如水溶性、低抗原性和功能性)賦予肽分子，同時修飾基團的空間位阻可抑制蛋白酶對肽鍵的水解，分子質量的提高可避免腎小球的過濾，從而提高肽在體內的穩定性，延長其半衰期和藥效。分子修飾是解決制約活性肽發展與應用問題行之有效的策略之一，也是近年來食品科學和藥學領域研究中的一個重要發展方向。脂質化、改變肽本身的結構(D型或非天然氨基酸替換、在肽鏈中引入非肽鍵結構)、陽離子化、糖基化以及聚乙二醇化等是常見的活性肽的化學修飾方式[36]。目前已報道的活性肽的化學修飾大多集中在抗菌肽上，抗氧化肽的相關研究相對較少。WANG等[37]研究發現，Zn2+配位修飾可顯著提高抗氧化肽對胃蛋白酶的消化抗性；CHEN等[38]研究證實，借助美拉德反應的糖基化修飾顯著增強了魚鱗肽的抗氧化活性。LIN等[39]用脈沖電場處理松籽抗氧化肽，產物的抗氧化活性得到了顯著的改善；ZHAO等[40]通過類蛋白反應修飾大豆蛋白水解物，發現產物的抗氧化活性明顯提高。YE等[41]以亞硒酸鈉為硒源，對大豆肽進行硒螯合修飾，發現與原大豆肽相比，大豆肽-硒螯合物的還原力和清除羥自由基的能力得到大幅度提升。總的來說，目前抗氧化肽的分子修飾大多采用簡單的物理或化學手段，還處于起步探索階段，仍有很大的潛力可供挖掘。

分子修飾后的抗氧化肽的安全性是一個必須要考慮的問題。郭洪輝等[42]通過小鼠急性毒性試驗證實，河豚魚皮膠原肽鋅螯合物的LD50為6.847 9 g/kg，屬于無毒級；YE等[41]用大豆肽的硒螯合物飼喂小鼠，結果表明，在實驗設定的處理條件下，大豆肽的硒螯合物既沒有導致小鼠氧化損傷，也未引起其他臨床變化。WANG等[43]研究發現，雞骨蛋白肽的糖基化修飾物在大鼠試驗中未顯示任何的毒副作用。當前，有關抗氧化肽分子修飾物安全性的報道較少，研究也不夠系統和深入。因此，抗氧化肽及其分子修飾物在作為天然抗氧化劑應用于功能性食品、化妝品以及醫藥行業之前，有必要進行一系列的毒理學檢測以及人類臨床試驗以進一步證實其安全性。

4 抗氧化肽的活性評價和作用機理

因為食物或生物系統中氧化過程的復雜性以及不同抗氧化劑可能有不同的抗氧化機制，所以尋找一種全面表征抗氧化肽抗氧化能力的方法并不容易。當前，國內外評價抗氧化肽抗氧化活性的方法主要有3種：(1)化學模型法，即通過檢測還原力、對各種自由基的清除能力、對過渡金屬離子的螯合能力及抗脂質過氧化能力等來反映抗氧化肽的抗氧化活性；(2)細胞生物法，即采用生物細胞或組織勻漿，通過引入ROS誘發氧化應激損傷，再根據一些相關的氧化和非氧化指標的檢測結果來評價抗氧化活性。細胞生物法比化學法更具生物學相關性，因為它考慮了抗氧化肽的細胞攝取、分布以及代謝等方面；(3)體內實驗法，即使用動物模型，通過測定血漿、肝臟、心臟及腦等組織超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛等抗氧化指標的變化來評估抗氧化肽的療效[44]。3種方法中，由于化學模型法具有操作簡便、高效、損耗小、便于重復及實驗周期短等特點，所以一直以來，抗氧化肽抗氧化活性的研究大多都淺表地停留在化學模型法檢測其是否具有體外抗氧化能力的層面上，僅有部分研究采用細胞模型或動物實驗對抗氧化肽的抗氧化活性進行深入分析[34]。另外，上述方法存在著“不同底物體外化學法的研究結果存在不一致性”、“體外化學法和細胞生物法的研究結果存在不一致性”以及“體內和體外實驗研究的結果存在不一致性”等問題。例如，通過檢測氧自由基吸收能力從卵轉鐵蛋白中鑒定出的16種抗氧化肽在人臍靜脈內皮細胞中并未顯示出抗氧化活性[33]。因此，如果抗氧化肽的目標應用涉及生物系統，那么評估肽的抗氧化活性僅用體外化學法是不夠的，至少還應在細胞培養模型中確定其抗氧化功效，然后再對其進行深入研究才有意義。

抗氧化肽的抗氧化作用涉及許多復雜機制的參與。據現有文獻報道[33]，抗氧化肽可通過提供還原力、清除自由基、螯合金屬離子、氧化損傷保護以及調節機體抗氧化/解毒酶活性等多種方式發揮抗氧化作用(圖2)。

圖2 抗氧化肽的作用機制

在體外化學模型中，抗氧化肽的抗氧化作用主要體現在清除自由基和抑制脂質過氧化。抗氧化肽清除自由基的機制有2種：氫原子轉移(hydrogen atom transfer，HAT)和單電子轉移(single electron transfer，SET)[2]。氧自由基吸收能力、總氧自由基清除能力和總抗氧化活性等是基于HAT的抗氧化活性檢測方法；鐵離子還原法是基于SET的抗氧化活性檢測方法；清除2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基能力的測定既利用了SET的直接還原機制，也涉及HAT機制來猝滅自由基[11]。含有酪氨酸、組氨酸和其他容易提供質子氨基酸的抗氧化肽的抗氧化作用通常是利用HAT機制，而富含組氨酸、半胱氨酸和色氨酸的抗氧化肽的抗氧化作用則使用SET機制[10]。亞油酸，低密度脂蛋白以及動植物脂肪等常用于體外化學模型中以評估抗氧化肽對脂質過氧化的抑制作用。在這些模型體系中，直接清除自由基、提供質子以阻斷自由基鏈式反應以及螯合金屬離子是抗氧化肽發揮脂質過氧化抑制作用的主要機制[2]。在細胞或動物模型中，抗氧化肽可通過減輕氧化應激反應來保護細胞或組織器官(如心、肝、腎及腦等)免受氧化損傷，其作用機制涉及清除自由基、調節氧化還原酶(如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物岐化酶和過氧化氫酶等)的活性、降低氨基酸轉移酶(谷草轉氨酶，谷丙轉氨酶)的活性、調節谷胱甘肽代謝以及調節抗氧化基因表達等多個方面，其中激活Nrf2-ARE信號通路以增強內源性抗氧化酶防御系統對于抗氧化肽在模型細胞或動物體內發揮抗氧化作用至關重要[2, 10, 15]。總的來說，當前通過細胞和動物模型對抗氧化肽作用機制的研究是有限的，抗氧化肽究竟以什么方式、何種途徑對生物細胞的氧化損傷進行保護和調控尚缺乏明確的共識。

5 生物信息學工具在抗氧化肽研究中的應用

生物信息學工具(Insilicotools)為預測、分析和篩選抗氧化肽提供了一種經濟、有效的手段，成為近年來抗氧化肽研究的一種新興方法。利用生物信息學工具可分析和挖掘數據庫中的各種蛋白質序列信息，尋找生物活性肽的潛在前體；預測所選蛋白質序列的潛在生物活性圖譜，計算所選蛋白質序列中潛在生物活性片段的出現頻率；分析酶切位點，篩選合適的蛋白酶，優化母體蛋白的可控水解；進行目標肽的生物活性預測，二級結構預測，感官特性(甜、苦、鮮味等)、毒性和過敏性預測以及理化性質(分子質量、等電點、疏水性、溶解性等)評價和構效關系分析等[45- 46]。基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)、BIOPEP數據庫工具以及分子對接工具(Molecular docking)等一些流行的生物信息學工具(表3)已廣泛應用于抗氧化肽的相關研究中。在這些工具的輔助下，已從動物、植物以及肉類等產品中成功地獲得了多種不同的抗氧化活性肽[35, 47-49]。

表3 抗氧化肽研究中的常用數據庫及工具

利用生物信息學工具進行抗氧化肽的初步模擬篩選，能夠讓研究人員可以專注于少數最有可能具有高效抗氧化活性的候選多肽。這種方法允許科研人員在用選定的蛋白質和酶的組合進行實驗操作之前，預先預測所得肽的種類、理化性質、感官特性以及生物活性[50]；生物信息學工具所預測肽的物理化學性質也可以為后續肽的分離純化提供指導[51]。生物信息學工具的應用，使抗氧化肽的研究變得更加經濟和高效，但利用這些工具進行計算機模擬的結果并非在實驗室操作中完全適用，因為，通過生物信息學工具的酶解過程以及生物活性的假設等是建立在蛋白質一級結構的基礎上，并未考慮二硫鍵、肽鏈的折疊狀態、蛋白翻譯后的修飾以及空間結構等對酶解作用的影響，也未考慮溫度、pH和離子強度等各種干擾因素的作用。因此，未來還需要進一步的工作來提升生物信息學工具對抗氧化肽的分析和預測能力。

6 抗氧化肽的開發前景與挑戰

不同來源的抗氧化肽具有分子質量小、活性較強、安全性好、成本低、易于吸收等優點，是合成抗氧化劑的潛在替代品，能夠對人類健康產生積極的影響，可作為控制食品氧化變質的功能性成分，也可以作為生產保健品、功能性食品、化妝品乃至藥品的多功能原料，在食品科學、藥學和生物學等領域都已顯示出極為廣闊的研究開發前景。然而，在抗氧化肽作為天然抗氧化劑大規模地應用到人類營養和健康領域之前，仍有許多科學和技術問題亟需解決:(1)由于酶解法產生的很多小肽結構相近，分子質量也相差不大，如何將目標抗氧化肽高效地進行分離純化以方便進行規模化生產是需要解決的首要問題。(2)盡管抗氧化肽在一些體內和體外試驗中顯示出良好的抗氧化活性，能預防氧化相關的疾病，并對人體健康產生有益的影響。但是，目前，尚無可用于評估肽抗氧化能力的標準化程序。(3)抗氧化肽的不穩定性是限制其在食品和藥物中應用的一個巨大障礙。有些抗氧化肽存在口服生物利用度低、半衰期短、肝臟和腎臟清除快等缺點，而且這些抗氧化肽還可能與食物基質中的組分相互作用，導致其活性降低，甚至產生不良產物。(4)抗氧化肽的定量構效關系還有待進一步驗證，在體內的作用機制尚未被完全闡明，這在一定程度上阻礙了抗氧化肽的工業化和商品化進程。(5)有關抗氧化活性以外的其他人類健康促進作用以及抗氧化肽的生物利用度、體內持久性和體內靶向性仍需要進一步研究。(6)部分抗氧化肽的苦味是其成為功能性食品或防治氧化損傷相關慢性疾病的藥物過程中的另一主要缺點。不過，隨著科學研究的不斷深入以及現代分離純化與檢測技術、分子修飾技術、分子與細胞生物學和各種組學技術以及生物信息學應用工具的快速發展，相信這些問題都將被一一解決，從而為抗氧化肽的開發應用開辟更加廣闊的空間。