基于P18蛋白基因的新型鴨呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

沈麗雅，潘群興，盧鳳英，董永毅，張敬峰，吳坤，劉青濤，姜平，張小飛

摘要：根據新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）特有的非結構蛋白P18基因保守序列設計1對特異性引物，建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法。用該方法和普通RT-PCR方法對239份臨床樣品進行檢測，NDRV陽性檢出率分別為23.85%（57/239）和17.57%（42/239），熒光定量RT-PCR檢測方法的檢出率明顯高于普通RT-PCR檢測方法。隨機取5份熒光定量RT-PCR檢測方法檢測的陽性的樣品用鴨胚進行病毒分離培養，經普通RT-PCR擴增和基因測序證明均為NDRV。用103.0 ELD50劑量的NDRV-SY株人工感染14日齡雛鴨，不同時間采集泄殖腔肛拭子樣品，通過熒光定量RT-PCR檢測方法進行排毒情況監測，結果顯示，雛鴨人工感染NDRV 48 h時可以從泄殖腔檢測到病毒排出，持續時間可達20 d，并發現在病毒感染后的第5 d和第10 d出現2次排毒高峰。試驗結果表明，建立的NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法具有良好的特異性和較高的敏感性，可用于NDRV感染的排毒監測以及臨床感染的早期診斷和流行病學調查。

關鍵詞：新型鴨呼腸孤病毒;P18蛋白基因;熒光定量RT-PCR

中圖分類號：S858.325.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1481-07

Establishment of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of novel duck reovirus based on the gene encoding P18 protein

SHEN Li-ya1，2，PAN Qun-xing1，LU Feng-ying1，DONG Yong-yi3，ZHANG Jing-feng1，WU Kun3，LIU Qing-tao1，JIANG Ping2，ZHANG Xiao-fei1

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.Jiangsu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention， Nanjing 210009， China）

Abstract：In order to rapidly detect the novel duck reovirus （NDRV）， the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established with a pair of specific primers designed according to the conservative gene sequence of the unique non-structural protein P18 of NDRV. 239 clinical samples were detected by the fluorescence quantitative RT-PCR method and ordinary RT-PCR methods， and the positive detection rates of the samples were 23.85% （57/239） and 17.57% （42/239）， respectively. The detection rate of fluorescence quantitative RT-PCR method was significantly higher than that of ordinary RT-PCR method. Five samples were randomly selected for virus culture with duck embryo from the NDRV positive samples by the fluorescence quantitative RT-PCR method. It was proved that the five isolated viruses were NDRV by ordinary RT-PCR amplification and DNA sequencing technique. The 14-day-old ducklings were artificially infected with NDRV-SY strain at a dose of 103.0ELD50， and the cloaca swabs of these ducklings were collected for NDRV detection by this fluorescence quantitative RT-PCR at different time points. The results showed that the inoculated ducklings shed virus as early as 48 hours post inoculation， and could continue until 20 days post inoculation. In addition， two peaks of viral titers were observed at five and ten days post inoculation. Therefore， the established fluorescence quantitative RT-PCR is specific and sensitive， and can be used for the detection of NDRV， early diagnosis of clinical infection and epidemiological investigation.

Key words：novel duck reovirus;gene encoding P18 protein;fluorescence quantitative RT-PCR

鴨呼腸孤病毒病已成為危害中國水禽養殖業的重要疫病，番鴨、麻鴨、半番鴨和北京鴨均可感染呼腸孤病毒（Reovirus，RV）并發病。根據宿主和病變的差異，鴨呼腸孤病毒病分為3種主要類型，即番鴨“白點病”、番鴨“新肝病”和北京鴨“脾壞死病”，其病原分別為MDRV[1-2]、新致病型番鴨呼腸孤病毒（New pathotype of Muscovy duck reovirus，N-MDRV）[3-4]和新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）[5-6]。2017年以來該病的發生率迅速上升，主要感染1月齡以內的雛鴨，且發病率和死亡率隨著日齡的減少而升高。感染NDRV使得雛鴨出現免疫抑制，往往繼發一些細菌性疾病，臨床上報道過大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌與NDRV混合感染的病例[7-8]。

NDRV的基因節段可分為3組，即L（大）、M（中）和S（小）共10個RNA片段，其中S組有S1、S2、S3、S4 4個基因片段[9-10]。NDRV的S1基因片段編碼非結構蛋白P10、P18和σC;而MDRV的P10和σC蛋白則是由S4基因片段編碼，缺少編碼P18蛋白對應的基因 [11-13]，因此，非結構蛋白P18基因為NDRV特有基因。研究結果顯示，在感染細胞后第6 h P18即可被檢測到，表明該蛋白質為病毒感染早期表達的非結構蛋白，參與病毒的復制[14-15]。因此本研究選擇NDRV P18蛋白基因為檢測靶標，建立NDRV熒光定量RT-PCR的檢測方法，并應用該方法檢測臨床送檢樣品和NDRV強毒株（SY株）人工感染雛鴨不同時間的排毒情況。

1材料與方法

1.1毒株、SPF雞胚、雛鴨

新型鴨呼腸孤病毒（NDRV SY株）、鴨源禽腺病毒4型（FAdV-4，SD2016-1株）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV，CA株）、鴨甲型肝炎病毒1型（DHAV-1，W株）、鴨甲型肝炎病毒3型（DHAV-3，SD株）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV，JS2010株）、鴨瘟病毒（DEV，AV1221株）、鴨圓環病毒（DuCV，AQ0901株）、鴨源H9亞型禽流感病毒（AIV-H9，NJ01株）由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存。SPF鴨胚購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所的SPF鴨種蛋，本實驗室孵化至11日齡;雛鴨由江蘇省農業科學院黃梅實驗動物基地NDRV抗體陰性麻鴨所產種蛋孵化。

1.2主要試劑

Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qRT-PCR （gDNA digester plus）反轉錄試劑盒、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix （High Rox Plus）熒光定量試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，核酸提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收盒購自Axygen 公司。

1.3熒光定量RT-PCR方法的建立

1.3.1引物的設計與合成根據已發表的NDRV P18蛋白基因的高度保守區序列，利用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計一對特異性引物，上游引物（Primer-F）為5′-CTTCGTGATGTCACTCCCGC-3′，下游引物（Primer-R）為5′-CGTCGCTTGACTGGTAGGGG-3′，預期目的片段大小為366 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2標準質粒的構建以NDRV SY株核酸為模板和NDRV P18蛋白基因特異性引物進行常規RT-PCR擴增，獲得NDRV P18蛋白基因片段，將其克隆到pMD18-T載體，獲得克隆質粒pMD18-P18。挑取重組菌并提取質粒進行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌送南京擎科生物技術有限公司測序，并與GenBank中的已公布的NDRV分離株序列進行同源性比較。

1.3.3熒光定量RT-PCR方法反應條件的優化以構建的重組pMD18-P18標準質粒為模板，采用HieffqPCR SYBR Green Master Mix（High Rox）試劑盒推薦的20 μl反應體系，對退火溫度（55～65 ℃）和引物量（0.1 μl、0.2 μl、0.4 μl、0.6 μl）進行優化。

1.3.4熒光定量RT-PCR方法標準曲線的建立將構建的重組pMD18-P18標準質粒按10倍梯度稀釋，取1μl 1.42×103～1.42×108拷貝的標準質粒為模板，用優化后的反應體系和反應條件進行檢測，以Ct值為縱坐標，以稀釋的陽性標準品拷貝數常用對數為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.5特異性試驗以NDRV、FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒的cDNA為模板，用優化后的反應條件進行熒光定量RT-PCR檢測，檢驗該方法的特異性。

1.3.6敏感性試驗以10倍倍比稀釋（1 μl 1.42×101～1.42×107拷貝）的標準質粒為模板，用優化后的反應條件進行熒光定量RT-PCR反應，檢驗該方法的敏感性。

1.3.7重復性試驗以同一批次提取的pMD18-P18陽性標準質粒的3個不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）和不同批次提取的陽性標準質粒的3個不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）為模板進行檢測，計算其組內變異系數和組間變異系數。

1.3.8臨床樣品檢測將2020年江蘇省、山東省等地區鴨場送檢的239份臨床樣品，提取核酸并反轉錄后，利用建立的NDRV熒光定量RT-PCR方法進行檢測，同時進行常規RT-PCR方法檢測[16]，比較檢測結果。

1.3.9病毒分離與鑒定隨機取5份熒光定量RT-PCR檢測NDRV陽性的樣品（脾臟或肝臟），分別用含雙抗各1 000 IU的生理鹽水制成1∶5勻漿，37 ℃作用1 h，凍融3次，6 000 g離心10 min，上清液用0.22 μm濾器過濾除菌，經尿囊腔途徑接種11日齡SPF鴨胚5枚，每1枚0.2 ml，37 ℃孵化，24 h內的死胚棄去，每日照胚2次，取出死胚置2～8 ℃暫存，至120 h時取出剩余胚置2～8 ℃過夜。無菌收獲尿囊液，按樣品將收獲的尿囊液混合，分別對5份鴨胚尿囊液混合樣進行RT-PCR擴增和測序分析，針對NDRV特有的P18蛋白基因設計的上游引物（P18-F）為5′-ATGTCACTCCCGCCAACC-3′，下游引物（P18-R ）為5′-CAGTTGTTGATTGTAGA T-3′，預期目的片段大小為488 bp。

1.3.10人工感染雛鴨試驗設置15只14日齡的健康雛鴨作為試驗組，每只腿部皮下注射1.0 ml NDRV-SY株（病毒滴毒為1 ml1×103 ELD50），另設置15只14日齡健康雛鴨作為對照組，每只腿部皮下注射1.0 ml生理鹽水。在攻毒后7 d，從試驗組和對照組隨機選擇9只雛鴨進行剖檢，觀察病理變化。攻毒后6 h開始用無菌棉簽采集雛鴨泄殖腔肛拭子樣品置于生理鹽水中，第1 d每隔6 h采集一次，2～3 d每隔12 h采集一次，4～30 d每天采集一次，-80 ℃保存。將采集的肛拭子樣品凍融3次后經漩渦振蕩，8 000 r/min離心4 min，取200 μl上清液，用試劑盒提取RNA，并反轉錄為cDNA，共收集到624份鴨肛拭子cDNA樣品（312份為NDRV人工感染麻鴨試驗組肛拭子cDNA，312份為健康雛鴨肛拭子cDNA）。用建立的熒光定量RT-PCR方法對樣品cDNA進行檢測，每個樣品重復3次，根據Ct值和熔解曲線分析NDRV感染鴨的排毒情況。

2結果

2.1重組pMD18-P18標準質粒的構建

重組pMD18-P18標準質粒經PCR鑒定，得到1條366 bp的特異性片段，與預期目的片段大小相符（圖1）。測序結果進行Blast比對，結果顯示，擴增的P18蛋白基因片段與GenBank上公布的NDRV不同分離株的 S1基因片段的P18蛋白基因序列同源性高達99.7%以上，表明PCR擴增的目的基因是NDRV病毒基因組中高度保守區序列， pMD18-P18質粒構建成功。

M：DNA marker 2 000;1：pMD18-P18標準質粒;2：陰性對照。

2.2熒光定量RT-PCR反應體系及條件優化

對引物量、退火溫度進行優化，最終確定NDRV實時熒光定量RT-PCR最優反應體系（20.0 μl）：Hieff qRT-PCR SYBR Green Master Mix（High Rox）10.0 μl，引物F/R（10 μmol/L）各0.1 μl，模板2.0 μl，DEPC水7.8 μl。最優反應條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，62 ℃ 45 s，40個循環。

2.3NDRV熒光定量RT-PCR標準曲線

將標準質粒10倍梯度稀釋為模板進行熒光定量RT-PCR反應，并繪制NDRV的標準曲線（圖2）。結果顯示，標準曲線在1 μl 1.42×103 ～1.42×108拷貝具有良好的線性關系，標準曲線的相關系數為0.998，擴增效率為90.105%。NDRV的拷貝數與Ct值之間的線性關系表達式為：Y=-3.582x+36.430，其斜率為-3.582，截距為36.43。依據此表達式，已知檢測樣品的Ct值，便可進行準確定量。NDRV標準質粒熔解曲線峰值單一（圖3），熔解溫度在84.94 ℃左右。

2.4NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法的特異性

用建立的熒光定量RT-PCR檢測方法對不同病毒的核酸進行檢測，結果顯示，只有NDRV病毒核酸有擴增曲線，判定為陽性，而FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒和陰性對照均未出現特異性擴增曲線（圖4）。

△Rn=每點測量的熒光強度-熒光基線強度。1： NDRV; 2～9： FAdV-4、MDRV、 DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9;10： 陰性對照。

2.5NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法的敏感性

用建立的實時熒光定量PCR檢測10倍梯度稀釋（1 μl 1.42×101～1.42×107拷貝）的陽性標準質粒。結果顯示，標準質粒均出現特異性擴增，該方法最低可以檢出1 μl 1.42×101拷貝的模板（圖5）。

△Rn=每點測量的熒光強度-熒光基線強度。

2.6NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法的重復性

對同一批次的標準質粒3個不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）和不同批次的標準質粒3個不同含量（1 μl 1.42×103 ～1.42×105拷貝）模板進行檢測。結果顯示，組內和組間Ct值變異系數均小于0.5% （表1）。

2.7臨床樣品檢測結果

用建立的熒光定量RT-PCR檢測方法對239份臨床樣品進行檢測，檢出陽性樣品57份，檢出率為23.85%;普通RT-PCR檢測方法檢出陽性樣品42份，檢出率為17.57%。臨床樣品檢出陽性率高于普通RT-PCR檢測方法，且二者的檢測符合率為93.7%。說明建立的熒光定量RT-PCR檢測方法比普通RT-PCR檢測方法更適合NDRV臨床的準確檢測（表2）。

2.8NDRV病毒分離與鑒定

5份熒光定量RT-PCR檢測NDRV陽性的組織樣品經處理后，分別接種11日齡 SPF鴨胚各5枚，5個樣品接種的鴨胚于接種后96～120 h均有1～2枚胚死亡。對每個接種樣品的死亡胚和120 h存活胚尿囊液收獲后混合，進行 P18蛋白基因RT-PCR擴增，5份樣品的鴨胚尿囊液均擴增出488 bp目的基因片段，大小與預期結果相符（圖6）。測序結果顯示，擴增的目的基因與NDRV 的P18蛋白基因序列一致，表明分離的5株病毒均為NDRV。

M：DNA marker 2 000;1～5：樣品1～樣品5;6：陽性對照;7：陰性對照。

2.9人工感染雛鴨試驗結果

NDRV SY株人工感染健康雛鴨后第7 d，從試驗組和對照組中，隨機選擇9只雛鴨剖檢。結果顯示，試驗組雛鴨肝臟腫大，有灰白色壞死點或出血斑;脾臟表面出現核桃皮狀、小米粒至綠豆粒大小的不規則壞死灶（圖7）。對照組肝、脾均無明顯病變（圖7）。

A：健康肝;B：壞死肝;C：健康脾;D：壞死脾。

用建立的熒光定量RT-PCR檢測方法對采集的雛鴨泄殖腔肛拭子樣品進行檢測，得到每只雛鴨各時間段樣品的Ct值，用標準曲線方程計算得出其對應的病毒拷貝數常用對數值，并計算各時間段平均值和標準差，繪制排毒規律曲線圖。如圖8所示，試驗組NDRV SY株感染鴨從第2 d（48 h）開始排毒，隨后排毒量不斷增加;第5 d達到第1個排毒高峰，病毒拷貝數為1 μl 1.42×102拷貝;第6～8 d，排毒量顯著減少，出現一個短暫的降低;從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加，第10 d形成第2個小高峰，病毒拷貝數為1 μl 1.42×101拷貝;個體排毒過程一直持續到第20 d左右，對照組均未檢出病毒。

48 h～7 d病毒載量為15只雛鴨肛拭子病毒拷貝數的平均值，每個樣品3次重復;8～20 d病毒載量為6只雛鴨肛拭子病毒拷貝數的平均值，每個樣品3次重復，結果用平均值±標準差表示，*、**表示每個時間點人工感染組病毒拷貝數與對照組之間差異達0.05和0.01顯著水平。

3討論

NDRV、MDRV和ADV都是禽呼腸孤病毒，生物學特征表現基本相同，但是臨床和抗原性表現存在較大的差異[17]。NDRV可感染各種鴨，不僅能引起雛鴨發病和死亡，還能引起免疫抑制和生長發育障礙，為NDRV的防控帶來極大的困難。因而，建立一種特異性強、靈敏度高的快速檢測方法對準確檢測NDRV十分重要。熒光定量RT-PCR檢測靈敏度高于普通RT-PCR，通常高100倍以上。張博等[18]根據NDRV σB基因的序列保守區，建立了TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法。以NDRV特有的非結構蛋白P18基因為檢測靶基因，該基因能將NDRV與MDRV和其他禽呼腸孤病毒區別開來[11-13]。P18蛋白還是病毒感染初期就表達的蛋白，參與病毒的復制。因此，針對NDRV P18蛋白基因進行檢測，有利于該病的早期診斷。

建立的熒光定量RT-PCR檢測方法靈敏度高，最低檢測限為1 μl 1.42×101拷貝的模板，與張博等[18]建立的熒光定量RT-PCR檢測方法的敏感性相同;比常規的RT-PCR檢測方法靈敏1 000倍[16];熔解曲線結果顯示，所擴增產物的Tm值基本相同，擴增特異性好;與其他常見鴨源性病毒無交叉反應，說明該方法具有很強的特異性;組內和組間的變異系數小于0.5%，表明該方法重復性好。對臨床樣品的檢測中發現，本熒光定量RT-PCR檢測方法的陽性檢出率為23.85%，高于普通RT-PCR檢測方法的17.57%，且二者的檢測符合率為93.7%。隨機選5份經熒光定量RT-PCR檢測方法檢出為陽性的樣品接種SPF鴨胚進行病毒分離培養，對各自收獲的鴨胚尿囊液用NDRV特有P18蛋白基因序列設計的引物進行PCR擴增，均擴增出預期大小的目的基因片段，基因測序結果顯示與NDRV 的P18蛋白基因序列一致，證明分離的5株病毒均為NDRV。試驗結果表明，建立的熒光定量RT-PCR檢測方法更適合NDRV快速診斷和流行病學調查。

NDRV SY株是由本實驗室從江蘇省沭陽縣采集并分離鑒定的強毒株[19]。用該毒株人工感染雛鴨動物試驗中，利用NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法對收集的624份鴨肛拭子cDNA樣品（312份為NDRV人工感染麻鴨試驗組肛拭子cDNA，312份為健康雛鴨肛拭子cDNA）進行檢測。結果顯示，試驗組NDRV-SY株感染鴨從第2 d（48 h）開始排毒，第5 d達到第1個排毒高峰，從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加，第10 d形成第2個小高峰，排毒期一直持續到20 d左右，這可能與NDRV在宿主體內的感染與復制有關。試驗組雛鴨在攻毒后第5 d起開始出現肝臟、脾臟壞死，在攻毒后第7 d肝臟、脾臟病變最為明顯，這與人工感染雛鴨排毒高峰期和變化趨勢相符合。

因此，本研究基于NDRV P18蛋白基因成功建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法適用于NDRV感染的排毒監測以及臨床感染的快速診斷和流行病學調查。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-03-19

基金項目：國家重點研發計劃項目（2017YFD0500804）;江蘇現代農業（水禽）產業技術體系疾病防控創新團隊項目[JATS（2020）321]

作者簡介：沈麗雅（1996-），女，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事動物傳染病防治研究。（Tel）15205172927;（E-mail）823320658@qq.com

通訊作者：張小飛，（E-mail）xiaofei0804@sina.com;姜平，（E-mail） jiangp@ njau.edu.cn