番紅花多柱頭突變體Cs5的轉錄組分析

李軍，吳霽蓂，高廣春，朱志明，李白，蔣琦，周鴻宇

關鍵詞：番紅花;柱頭;突變體;轉錄組

中圖分類號：S567.23+9文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1630-03

Transcriptome analysis of saffron mutant Cs5 with multiple stigmas

LI Jun1，WU Ji-ming2，GAO Guang-chun2，ZHU Zhi-ming3，LI Bai4，JIANG Qi2，ZHOU Hong-yu2

（1. School of Modern Agriculture， Jiaxing Vocational & Technical College， Jiaxing 314036， China;2.School of Medicine Science， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China;3.Jiaxing Xiuzhou Tianhe Saffron Professional Cooperative， Jiaxing 314000， China;4.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences， Jiaxing 314016， China）

Key words： saffron;stigma;mutant;transcriptome

番紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬球莖類藥用植物，以其干燥柱頭入藥，具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，同時也應用于食品、化妝品行業染料及香料的制作[1-2]。番紅花在浙江、江蘇、上海、四川等地廣泛栽培，但全國種植面積不到667 hm2，占市場需求量的20%左右，大部分還是依賴進口，因此番紅花的需求量非常大。然而，由于番紅花為三倍體雄性不育植物，僅靠球莖進行營養繁殖，而且每一朵花只有3個柱頭，所以產量極低[3-4]。因此，培育高產優質的番紅花品種將有效緩解國內外番紅花市場的供求矛盾，具有重要的基礎理論研究價值和產業應用前景。

野生型番紅花的花為頂生;花被片6個，淡紫色，長4～6 cm;雄蕊3個，雌蕊三心皮合生，子房下位，花柱細長，黃色柱頭3個，伸出花被筒外后下垂，深紅色，頂端略膨大。本研究在番紅花生產過程中發現了多柱頭突變體Cs5，其雌蕊上端花柱和柱頭數量均為5個，形態與野生型無異，花柱聚合后比野生型粗壯（圖1）。柱頭數量的增多有助于提高番紅花花絲的產量及花農收入，是番紅花新品種培育的主要方向。通過轉錄組學和代謝組學，結合共表達網絡分析番紅花柱頭發育的調控基因AGL6，發現其可能通過影響花器官的發育進而影響柱頭的生物量，最終影響次生代謝物的產量[2，5-6]。番紅花柱頭數量是影響產量的一個重要指標，調控其生長發育的結構基因的挖掘和調控機制的研究有助于解決番紅花資源短缺問題，然而目前相關研究報道較少。

目前，RNA-Seq分析測試技術在植物特異突變、特定發育時期以及不同組織器官基因差異表達等方面的研究中廣泛應用[7-9]。本研究擬對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭及其野生型柱頭進行轉錄組測序和生物信息學比較分析，篩選差異表達基因，分析基因功能以及相關的代謝通路，以期為研究影響番紅花柱頭數量的相關調控基因及相關信號通路提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

番紅花多柱頭突變體Cs5樣本為浙江省嘉興市農業科學研究院番紅花種植基地里的自然突變體，其雄蕊、花柱和柱頭的數量均為5個，均比野生型多2個。于盛花期分別采集番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的柱頭，每10個1組，設3次重復，于-80 ℃超低溫冰箱中凍存，用于后續試驗。

取各處理組的樣品各0.1 g，液氮研磨，采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒（Invitrogen公司產品）提取柱頭的總RNA，在Illumina HiSeq2500儀器（上海美吉生物醫藥科技有限公司產品）上進行RNA-Seq測序。

1.2差異表達基因分析和功能注釋

采用Trinity軟件將各處理組的有效數據組裝成對應的轉錄本序列，用Blast軟件將各樣品測序得到的所測讀段與Unigene庫進行比對，利用DESeq軟件以錯誤發現率（FDR）≤0.05且log2 Fold Change≥1為條件篩選差異表達基因（DEGs）。使用Blast軟件將DEGs與NR、SWISS、GO、COG、KEGG數據庫信息進行比對，獲得相應的注釋信息。

1.3差異表達基因的驗證及表達模式分析

分別選取10個差異表達基因，利用實時熒光定量PCR驗證測序數據的可靠性，以及差異表達基因在花瓣、葉片、球莖、雄蕊、柱頭等不同組織中的表達模式。實時熒光定量PCR：總反應體積20 μl，反應條件為95 ℃預變性2 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環數為40個，72 ℃延伸30 s。用2-△△Ct計算基因表達差異。

差異表達基因實時熒光定量PCR驗證和表達模式分析的數據用GraphPad Prism5.0軟件進行統計處理，采用One-way ANOVA進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1基因組裝分析

利用Illumina HiSeq2500儀器進行無參轉錄組測序，番紅花多柱頭突變體Cs5產生了60 063 054條序列數，野生型產生了54 706 306條序列數，各處理組的G、C基本隨機分布，無明顯偏差。質量控制分析后，突變體保留54 984 766條序列，野生型保留49 715 722條序列。采用Trinity軟件對數據進行組裝，對得到的52 317條Unigenes分別進行功能注釋，其中NR數據庫29 392條，GO數據庫20 510條，COG數據庫21 126條，KEGG數據庫12 875條，SWISS數據庫20 510條，其中NR數據庫注釋比最高，達56.18%。

2.2差異表達基因分析

對番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的轉錄組數據進行差異分析，共篩選出917個差異表達基因，其中番紅花多柱頭突變體Cs5中有412個（約占44.93%）基因表達上調，505個（約占55.07%）基因表達下調。顯著差異表達基因中包括MADS家族轉錄因子基因15個（包含9個已鑒定的番紅花MADS類轉錄因子基因），MYB家族轉錄因子基因19個，BHLH家族轉錄因子基因7個，WRKY家族轉錄因子基因5個，SEUSS家族轉錄因子基因6個，TF1轉錄因子基因1個，與植物激素相關的轉錄因子基因23個，這些轉錄因子基因大多與植物花發育相關。

2.3實時熒光定量PCR驗證差異表達基因

為了進一步驗證測序結果的可靠性，從917個差異表達基因中隨機選擇10個差異表達基因（包含3個上調表達基因，7個下調表達基因）進行實時熒光定量PCR驗證，與轉錄組數據比較后發現，這10個基因的表達情況與測序結果一致，說明本次轉錄組測序結果真實可信。

2.4DEGs的GO功能注釋分析

對番紅花多柱頭突變體DEGs進行GO功能注釋分析，有316個基因被注釋到41個分類條目上，包括145個上調基因和171個下調基因。這些基因功能分為生物過程、細胞組分和分子功能3大類，分別包含141、103、72個條目。對這3類條目的二級分類結果進行統計分析，發現DEGs在生物過程條目中主要分布在細胞過程和代謝過程，在細胞組分條目中主要包括共質體和細胞膜等，在分子功能條目中主要包括結合活性和催化活性。

2.5DEGs的KEGG功能注釋分析

通過與KEGG數據庫比對，對所有DEGs進行功能注釋和富集分析。結果顯示，917個差異表達基因被富集在179個代謝通路中，以校正P值<0.05為條件篩選出20個顯著富集的代謝通路，包括次生代謝產物生物合成、植物激素信號轉導、RNA轉運、淀粉和蔗糖代謝等。植物激素信號轉導中富集了5個差異表達基因，涉及生長素、赤霉素、脫落酸的代謝通路，植物激素在植物生長發育的不同時期和不同組織器官中均發揮重要的作用，番紅花多柱頭突變體Cs5的性狀很有可能與激素表達、信號轉導密切相關。

2.6DEGs表達模式分析

從917個差異表達基因中隨機選取10個差異表達基因，通過實時熒光定量PCR技術分析其在番紅花不同組織器官里的表達情況。本研究結果表明，DN34196、DN30594、DN41391、DN24459和DN39219共5個差異表達基因在番紅花柱頭中的表達量與其在雄蕊、花瓣、葉片和球莖中的表達量有極顯著差異（P<0.01）;DN26020在番紅花柱頭中的表達量與其在雄蕊和花瓣中的表達量無顯著差異，與其在葉片和球莖中的表達量存在極顯著差異（P<0.01）;DN17686和DN31280在柱頭中的表達量與其在葉片中的表達量無顯著差異，與其在雄蕊、花瓣和球莖中的表達量存在極顯著差異（P<0.01）。

3討論

番紅花作為經濟價值極高的藥用植物，藥用部位的產量一直是科研人員關注的焦點[10-11]。本研究通過轉錄組測序技術對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭和野生型番紅花柱頭進行轉錄組分析，從中發現可能與柱頭發育相關的轉錄因子包括MADS家族、MYB家族、BHLH家族、WRKY家族、SEUSS家族以及與植物激素相關的轉錄因子。另外，番紅花突變體中MADS-box基因包含A Class （AP1）、B Class （PI/AP3）、C Class（AG）、D Class（AGL）和E Class（SEP），說明番紅花花發育過程也涉及到5類基因在不同時間和空間的精確表達[6]。

植物自身激素水平在雌蕊發育過程中扮演著重要角色，本研究發現一批與生長素、赤霉素、細胞分裂素和脫落酸的合成、失活及信號轉導途徑調控相關的轉錄因子，通過這些轉錄因子的調控可以維持植物包括雌蕊在內的花器官的正常發育[12-13]。番紅花柱頭的發育質量和數量直接影響其經濟價值，多柱頭突變體的發現一方面可以為通過組培快繁技術快速擴繁突變體數量，提高番紅花產量的研究提供試驗材料，另一方面本研究獲得的轉錄組分析數據使得解析多柱頭突變體形成機制，以及通過生物技術調控、創制更多突變體成為了可能。隨著基因組﹑轉錄組和蛋白質組學技術的發展以及分子生物學技術的不斷提高，相信將來在番紅花柱頭生長發育調控網絡上的一些蛋白質生物學功能和基因間互作關系的研究會有更大突破。

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（責任編輯：王妮）

收稿日期：2021-04-12

基金項目：國家自然科學基金項目（81703667）;嘉興市公益性研究計劃項目（2020AY10023）;浙江省大學生科技創新計劃項目（2020R417016）;嘉興市科技特派員專項項目（2021K117）;嘉興學院大學生創新創業能力個性化培養項目

作者簡介：李軍（1981-），男，山東泰安人，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學研究。（E-mail）lijunjx1@163.com

通訊作者：高廣春，（E-mail）gaogcjx@163.com