辣椒miR169及其靶基因的生物信息學分析

劉雪梅，王悅，李瑋琦，魏繼承，任如意，郝愛平

摘要：為了解miR169基因家族在辣椒生長發育過程的重要調控作用，通過生物信息學的方法對can-miR169基因家族的成員進行了染色體定位、序列保守性分析、系統發育進化樹分析、前體序列二級結構預測和靶基因預測。結果表明：can-miR169家族成員定位在4條染色體上;成熟序列高度保守，前體序列在產生成熟序列的位置高度保守;預測結果顯示can-miR169家族成員均有靶基因，這些靶基因主要以靶基因核因子A（NF-YA）復合物為主，且大體相同。這些靶基因可以參與到種子萌發、植株發育和對外界環境脅迫的應答等多種生命活動中。

關鍵詞：miR169;辣椒;生物信息學;NF-YA

中圖分類號：S641.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1510-06

Bioinformatics analysis of miR169 and its target genes in pepper

LIU Xue-mei，WANG Yue，LI Wei-qi，WEI Ji-cheng，REN Ru-yi，HAO Ai-ping

（ College of Life Sciences and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， China）

Abstract： In order to understand the important regulatory role of miR169 gene family in the growth and development of pepper， the members of can-miR169 gene family were analyzed by bioinformatics， including chromosome mapping， sequence conservation analysis， phylogenetic tree analysis， precursor sequence secondary structure prediction and target gene prediction. The results showed that the members of can-miR169 family were located on four chromosomes， the mature sequence was highly conserved. The precursor sequence was highly conserved in the position where the mature sequence was produced. The forecasting results indicated that all members of can-miR169 family had target genes， which were mainly composed of nuclear factor Y （NF-YA） complexes and were roughly the same. These target genes can be involved in a variety of life activities such as seed germination， plant development and response to external environmental stress.

Key words：miR169;pepper;bioinformatics;NF-YA

MicroRNA（miRNA）是真核生物體中內生的，長度大致為20～24個核苷酸[1]，具有一定的保守性、時序性和結構特異性的非編碼小分子RNA。miRNA調控植物的生長發育、信號轉導和對外界環境非生物脅迫的響應等生命活動[2]。一個miRNA可能具有一個或多個靶基因，且miRNA一般都是通過對靶基因的切割和翻譯抑制[3]對靶基因進行調控。

從目前的研究結果來看，miRNA家族龐大且調控方式復雜，其中，miR169是植物miRNA中幾個最大的miRNA家族之一，僅水稻miR169家族就登記了十幾個家族成員，且成員間具有大體相同的成熟序列和靶基因。近年，越來越多的科研人員研究了miR169對植物的逆境調控作用。Li等[4]發現miR169可在水稻抗稻瘟病中起負調節作用。陳禹彤等[5]發現miR169o可以參與干旱脅迫的應答。舒李露等[6]發現當miR169過表達時能夠促進山核桃植株提前開花。阮先樂等[7]發現油菜miR169可以參與到非生物脅迫的應答中。而董云等[8]進一步研究發現油菜miR169d也可以通過對靶基因的調控實現早花。方輝等[9]發現葡萄miR169是重要的生長發育和逆境脅迫的調控元件。Sorin等[10]發現擬南芥miR169通過調節靶基因核因子A（NF-YA）來直接或間接地參與到植物對環境信號的應答中。Serivichyaswat等[11]發現擬南芥miR169可以對外界溫度的影響進行負調控。Hanemian等[12]發現在擬南芥抗青枯病突變體中miR169表現為負調控，miR169的過表達則使突變株失去抗性。Yu等 [13]發現在大豆中gma-miR169c通過抑制其靶基因NF-YA復合物的表達來對大豆干旱脅迫的應答起負調控作用，是一種應對干旱脅迫的候選miRNA。Zhang等[14]發現在番茄中sly-miR169c的過表達增強了番茄的耐旱性。

在以往的研究中，NF-YA轉錄因子在不同植物中的作用也被一點點地挖掘出來。Marcoantonio等[15]研究發現NF-YA過表達可以延緩某種因脅迫造成的植物衰老。NF-YA可以抑制一些包括早期ABA介導的基因表達，還可以通過降低植物的生長速率來實現對非生物脅迫的調控，而且一般含有NF-YA復合物的植物對外界環境脅迫所誘導的植物衰老具有一定的耐受性。Ni等[16]發現在大豆中NF-YA與抗旱息息相關，NF-YA可以通過增強大豆對高鹽度和外源ABA的敏感性來發揮自己在正調控植物抗旱性的重要作用。

辣椒在中國是一種十分重要的蔬菜作物，能夠帶來很大的經濟效益，但是產量易受環境因素的影響[17-19]。環境脅迫已成為制約農業發展的主要限制因子，發掘利用植物自身的抗逆境能力， 選育優良品種已成為重要課題[20]。辣椒miR169（can-miR169）家族之中成員較多且在辣椒的生長過程中可能具有復雜的調控關系，但具體的作用機理以及調控機制尚未知道。本研究將利用Phytozome等數據庫以及多種在線軟件對can-miR169基因家族的序列分布、染色體定位特征、二級結構、發育進化樹以及靶基因的調控機理進行一定的生物信息學分析，以期明確can-miR169在辣椒生長過程中的調控作用，為辣椒抗逆性研究以及優秀品種選育等提供參考數據。

1材料與方法

1.1數據來源

在miRNA數據庫PmiREN（http：//www.pmiren.com/）中直接搜索can-miR169數據，并通過下載的方式獲得can-miR169家族的全部15名成員的成熟序列。

1.2染色體定位

將can-miR169家族全部成員的前體序列以FASTA格式提交至數據庫PEPPER GENOME（http：//peppergenome.snu.ac.kr/）中通過在線比對的方式獲得染色體定位信息，其中參數設置均為默認值。

1.3前體序列二級結構預測

將can-miR169的前體序列以FASTA格式提交至RNAfoldWebServer（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）中，預測can-miR169基因家族的全部成員的前體二級結構，其中參數均為默認。

1.4序列比對分析與系統發育進化樹分析

利用Multiple Sequence Alignment（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和ESPript3.X（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）對can-miR169的成熟序列進行多序列比對，結果利用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制序列保守性圖片。Logo圖可以顯示出序列中每個位置上堿基出現的頻率以及序列保守程度。其中參數均為默認值。利用MEGA X通過鄰近法（Neighbor-Joining method）繪制can-miR169基因家族的系統發育進化樹，其中Bootstrap設置為1 000次，其余參數均為默認值。

1.5靶基因預測

利用PmiREN（http：//www.pmiren.com/）和WMD3（http：//wmd3.weigelworld.org/cgi）的在線預測獲得can-miR169家族成員的靶基因預測信息，結果再通過利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Nucleotide數據庫以及BLAST的在線比對進行靶基因的功能注釋。

2結果與分析

2.1can-miR169家族成熟序列分析及其基因定位結果

利用PmiREN數據庫搜索到15個can-miR169基因家族成員（表1），結果顯示除can-miR169c和can-miR169g的長度為22個堿基外其余13個成員的長度均為21個堿基。利用數據庫PEPPER GENOME對全部15個成員進行定位，結果顯示15個基因序列分布在4條染色體上，分別為染色體2、染色體4、染色體7、染色體8。其中有8個成員位于染色體7上，分別為can-miR169a、can-miR169b、 can-miR169e、 can-miR169f 、can-miR169g、 can-miR169j、can-miR169k、 can-miR169l，有5個成員位于染色體8上，分別為can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n、can-miR169o，其余2個成員中can-miR169c位于染色體2上，can-miR169i位于染色體4上。

2.2can-miR169家族成員成熟序列的保守性分析

利用Multiple Sequence Alignment和ESPript 3.X對can-miR169家族成員成熟序列及前體序列進行保守性分析（圖1），并利用WebLogo對結果繪制了更為直觀的序列保守性對比圖（圖2）。由圖1和圖2可以看出can-miR169家族成熟序列中18個堿基完全保守，另有2個堿基高度保守，其余堿基保守性較低甚至不保守，而且can-miR169a、can-miR169b、can-miR169i、can-miR169j、can-miR169k、can-miR169l、can-miRm、can-miR169n、can-miR169o和can-miRd、can-miRe、can-miRf成熟序列堿基完全相同。前體序列高度保守區域幾乎與成熟序列完全重合，而前體序列其余位置保守性差應可能是其處于不同發育階段不同的植物組織中造成的。

2.3can-miR169基因家族前體序列二級結構預測

利用在線軟件RNAfoldWebServer對can-miR169基因家族前體序列進行二級結構預測。結果顯示can-miR169基因家族成員均能形成穩定的莖環架構。在這些家族成員中，其結構特點與Luan等[21]研究結果相同，can-miR169二級莖環結構高度可變，高度保守結構均位于莖區，其他區域在大小和莖環結構差異很大。挑選出幾個較為典型的二級結構預測圖（can-miR169a、can-miR169g、can-miR169k、can-miR169n二級結構預測圖）作為展示（圖3）。

2.4can-miR169家族前體序列的系統發育進化樹分析

利用MEGA X對can-miR169基因家族的前體序列進行比對分析并繪制系統發育進化樹。結果顯示，前體序列進化樹（圖4）顯示，can-miR169 15個成員除can-miR169o、can-miR169c外，共分為3個分支：can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n（分支Ⅰ），can-miR169a、can-miR169b、can-miR169l、can-miR169i（第Ⅱ分支），can-miR169e、can-miR169g、can-miR169f、can-miR169j、can-miR169k（分支Ⅲ）。從進化樹上看，can-miar169o、can-miR169c應比其他成員產生早，兩者序列差異也較其他序列大。與此同時參考了miRNA數據庫PmiREN中成熟序列表達位置和RPM值信息，大部分can-miR169成員的主要表達位置為植物的根和莖，只有can-miR169c在植物根、莖、葉、花、果實中極少量表達。結合進化樹，可解釋can-miR19c成熟序列與其他成熟序列差異最大。因此推測can-miR169基因在其進化過程中發生了較多堿基突變、替換等現象，或者其進化過程更為復雜，這與蔣夢琦等[22]關于miR156家族的序列分析結果類似，即不同成員由于不同時間不同速度進化或所處于植物體不同的組織中從而導致前體序列差異較大，同時也證明了其在進化過程中功能區的保守性。

2.5can-miR169家族靶基因預測

利用數據庫PmiREN和在線軟件WMD3的初步預測以及NCBI的BLAST在線比對，獲得了一個較為準確的can-miR169靶基因預測結果（表2）。結果顯示，除can-miR169g外，其余成員均具有多個靶基因且大多數都為NF-YA轉錄因子基因，說明NF-YA轉錄因子基因是can-miR169家族的重要靶基因。這些靶基因編碼產物中包含了多種轉錄因子和多種蛋白質，說明miR169參與調控了辣椒的多種生命活動，參與了辣椒的多種代謝活動。這為以后can-miR169-NF-YA非生物脅迫代謝途徑研究提供了理論基礎。

3討論

到目前為止，科研工作者已經從35種植物中發現了超400個miR169基因家族成員[23-24]。本研究利用生物信息學方法對can-miR169基因家族的成熟序列和前體序列進行了保守性分析、系統發育進化樹分析、二級結構預測和靶基因預測，至此我們對can-miR169基因家族有了初步的了解。本研究結果顯示，can-miR169基因家族共有15個家族成員，且這15個家族成員在成熟序列中保守性較高，在前體序列中位于成熟序列產生位置的堿基保守性較高。通過對can-miR169基因家族前體序列的系統發育進化樹的分析可以看出，前體序列在進化過程中因處于不同植物組織在不同時間以不同的速率發生堿基突變和缺失從而產生了除莖區外幾乎不具保守區的特點。

通過對靶基因的預測不難看出can-miR169家族成員除can-miR169g外都具有多個靶基因并且這些靶基因大體相同。這不僅表明在辣椒中miR169家族參與了多種生命活動的調控，也表明了在辣椒中miR169家族具有大體相同的調控作用。在can-miR169家族眾多的靶基因中，大多數為NF-YA轉錄因子基因，這說明NF-YA轉錄因子基因是can-miR169家族的主要靶基因。徐妙云等 [25]發現在玉米中NF-YA能提高玉米對外界脅迫的耐受性。NF-YA通過調控根系來作為對外界干旱、高鹽等非生物脅迫的應答，提高玉米對外界環境脅迫的耐受性。Zhao等[26]發現在水稻中NF-Y復合物可以起到一定的抗旱作用，在對水稻miR169家族成員進行高鹽誘導的研究中發現大量NF-Y亞基在干旱條件下受到抑制，說明調控NF-Y復合物的某些基因表達被關閉，進而說明NF-Y復合物在植物抗旱中發揮重要作用。Li等[27]研究發現NF-YA5同樣在植物抗旱方面可以起到作用，NF-YA5可以通過在植物保衛細胞中的表達或者對氣孔大小的調控來實現對植物抗旱性的調控，另外這也證明NF-YA復合物在植物抗旱性方面的調控作用是必不可少的。辣椒每年受干旱影響造成產量減少的情況頻發，通過對can-miR169基因家族的生物信息學分析，可以為辣椒抗旱優良品種的選育與性狀改良提供思路和理論基礎。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-04-20

基金項目：牡丹江師范學院科研項目（YB2020005）;黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目（1353MSYYB011）

作者簡介：劉雪梅（1996-）女，貴州黔東南人，碩士，研究方向為分子生物學與生物化學。（E-mail）lxm12252021@163.com

通訊作者：郝愛平，（E-mail）swxhap@126.com