養肝活血湯對酒精性肝病大鼠的影響*

趙紅兵，張春雨，賈文霞，宋青，張英

呼和浩特市蒙醫中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010010

長期酗酒可造成肝臟不同程度損傷，甚至導致死亡。酒精主要通過肝臟吸收代謝，同時過量酒精對肝臟危害極大。飲酒量越大，持續時間越長，就越容易引起酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），卻與酒的種類無相關性。ALD在歐美國家發病率較高，特別是美國，肝硬變死亡人數大約一半與長期酒精有關［1－4］。

酒精在很大程度損害肝臟，嗜酒者基本都有不同程度的脂肪肝，其中高達35%的飲酒者會發展為ALD，其中10%的ALD會發展為肝硬變。近幾年，在中國ALD的發病率顯著上升，已達6.1%。可引起肝硬變、肝纖維化，使機體的肝臟功能紊亂，人們生活健康受到很大的影響［5－7］。

ALD對人體的危害是不斷發展的，從輕度脂肪肝發展到酒精性肝炎，進一步發展為酒精性肝纖維化，甚至肝硬變。在整個疾病發展過程中，這幾種肝臟損害可以同時存在。ALD屬于中醫“脅痛”“酒疸”等范疇。根據臨床表現，ALD、酒精性肝炎屬于“脅痛”，酒精性肝纖維化、肝硬變相當于“酒癖”“酒臌”。ALD的病因病機包括痰濕、濕熱、氣滯血瘀等病因傷及肝臟，又因肝脾同病、肝腎同源，氣、血、濕、痰等停于中下焦，氣滯血瘀，凝結于腹中，形成酒臌證。

近些年，中醫藥治療ALD多具有明顯優勢，筆者根據多年臨床經驗，自擬養肝活血湯治療ALD，取得滿意療效。本研究應用養肝活血湯治療大鼠ALD，檢測天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransfease，ALT）及肝臟中磷酸化的c2Jun氨基末端激酶（phosphorylation－c2 JunN2 terminalkinase，p－JNK），觀察白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）和白細胞介素6（interleukin－6，IL－6）蛋白水平的變化，為今后臨床治療ALD奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級SD大鼠120只，雌雄各半，體質量150～170 g。質量合格證號：1100111911008773，湖南光琇高新生命科技有限公司。

1.2 藥材與試劑養肝活血湯，藥物組成：太子參10 g，玉竹10 g，黃精10 g，丹參10 g，水蛭10 g，赤芍15 g，黃芩10 g，郁金10 g，九香蟲10 g，大黃6 g，甘草10 g，由呼和浩特市蒙醫中醫醫院藥房提供。橄欖油（Sigma公司）；吡唑（上海撫生實業有限公司）；硫普羅寧鈉腸溶片（上海承良醫藥科技股份有限公司，批號A14202073232），由蒸餾水溶解。

1.3 分組與造模將120只SD大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組、養肝活血湯組、硫普羅寧鈉組，每組各30只，均飼以普通飼料、自由進食，自由飲自來水喂養1周后，模型對照組、養肝活血湯組、硫普羅寧鈉組飼以普通飼料，每天灌胃白酒、橄欖油、吡唑混合液，酒的攝入量為89～129 kg·d－1，隨時間的延長而遞增，橄欖油的攝入量為29 g·kg－1·d－1，吡唑攝入量為24 mg·kg－1·d－1，造模時間為12周。各組處死10只，觀察造模是否成功［8］。

1.4 給藥方法養肝活血湯組給予12.8 g·kg－1養肝活血湯灌胃（根據臨床使用的成人每日服用劑量，劑量為成人的7倍）。硫普羅寧鈉組給予60 mg·kg－1硫普羅寧鈉水溶液灌胃。空白對照組及模型對照組均給予同體積的蒸餾水灌胃，每日1次。

1.5 觀察指標

1.5.1 生化指標 造模第10天給藥6 h后，收集大鼠血液，分離血清，檢測AST、ALT水平。

1.5.2 Western Blot法檢測大鼠肝臟中蛋白的表達提取大鼠肝臟中的蛋白質，檢測各組大鼠肝臟中IL－6、IL－1β、JNK及p－JNK蛋白表達的變化。將大鼠肝臟中的蛋白質通過SDS－PAGE電泳，然后轉膜到PVDF膜上，進行一抗孵育，二抗孵育，ECL液顯色之后進行拍照，分析條帶圖像。

1.6 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件分析，正態分布計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況空白對照組大鼠行動靈活；模型對照組大鼠酒后撓嘴，走路不穩等；養肝活血湯組大鼠行動靈活，沒有異常行為；硫普羅寧鈉組大鼠行動靈活，沒有異常行為。

2.2 各組大鼠血清中AST、ALT水平比較與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清中AST、ALT均明顯升高（P＜0.05），可見造模成功。與模型組比較，養肝活血湯組和硫普羅寧鈉組大鼠血清中AST、ALT明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中AST、ALT水平比較 （s，IU·L－1）

表1 各組大鼠血清中AST、ALT水平比較 （s，IU·L－1）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05

組別 n AST ALT空白對照組 30 41.13±2.11* 61.27±3.35*模型對照組 30 66.21±3.71 121.18±4.32養肝活血湯組 30 46.15±2.28* 83.12±5.23*硫普羅寧鈉組 30 44.13±2.34* 75.14±6.38*

2.3 各組大鼠肝臟中蛋白表達結果與空白對照組比較，模型對照組大鼠肝臟中p－JNK、IL－1β、IL－6的蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，養肝活血湯組和硫普羅寧鈉組肝臟中p－JNK、IL－1β、IL－6的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠肝臟中蛋白的表達

表2 各組大鼠肝臟中蛋白的表達

注：模型對照組比較，*P＜0.05

組別 n p－JNK／JNK IL－1β／β－actin IL－6／β－actin空白對照組 30 0.13±0.04* 0.11±0.05* 0.13±0.06*模型對照組 30 1.04±0.10 0.98±0.11 1.07±0.09養肝活血湯組 30 0.92±0.06* 0.62±0.08* 0.58±0.05*硫普羅寧鈉組 30 0.66±0.11* 0.56±0.10* 0.54±0.07*

圖1 各組大鼠肝臟中蛋白的表達

3 討論

ALD在我國特別是在內蒙古自治區屬于高發病［8］。酒精代謝所需要的兩種主要酶為乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）。酒精在機體氧化為乙酸，主要在肝臟代謝，通ADH和ALDH 來實現，其中乙醛毒性較強，也是乙醇在肝臟代謝中的重要產物［9－11］。同時，在人體中，乙醛可以與一些蛋白發生共價結合反應，產生活性不同的乙醛蛋白物。在乙醇氧化的過程中，主要變現為氧化型的輔酶Ι（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）向還原型輔酶Ι（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）轉變，導致NADH／NAD比例增加。長期嗜酒者會對肝臟造成損害，可以減緩氧化型的輔酶I向還原型輔酶Ι的轉變，延緩轉變時間［12］。

ALD對人體的危害是不斷發展的，從輕度脂肪肝發展到酒精性肝炎，進一步發展為酒精性肝纖維化，甚至肝硬變［13］。戒酒是治療ALD的前提，改變飲食習慣，能減輕ALD患者的臨床癥狀，實現氮平衡。目前，現有藥物治療不佳，很多藥物還處于試驗中［14］。而中醫學治療ALD具有較大的優勢，通過辨證論治，結合經方治療，取得滿意的臨床效果［15］。

本研究發現與模型對照組比較，養肝活血湯組大鼠治療后血清中AST，ALT均降低，說明養肝活血湯能夠抑制ALD的發展，改善肝臟功能。大量研究表明JNK途徑對細胞的炎癥因子的分泌有調控作用。為了進一步研究養肝活血湯的作用，本研究檢測了大鼠肝細胞中炎性因子IL－1β和IL－6的變化，同樣證明了養肝活血湯對大鼠肝細胞炎性因子的表達有抑制作用。為了進一步研究調控炎性因子表達的機制，本研究檢測了p－JNK的情況，表明養肝活血湯對ALD p－JNK的表達有抑制作用。這就說明，養肝活血湯對ALD炎性因子的表達調控通過p－JNK來實現的。

ALD在疾病發展的各個階段中，對人體的損害僅次于傳染性肝病。肝臟是人體最主要的代謝臟器，起著非常重要作用，而酒精往往對肝臟損傷最大［16－17］，中醫學在治療ALD具有較大的優勢，通過辨證論治，取得滿意的臨床效果。同時中藥對肝硬變、肝纖維化的治療療效較好，目前，對ALD的研究存在一定的問題，一是對ALD的辨證論治、病因病機及療效制定標準沒有形成共識；二是沒有科學設計、合理對照及明確的檢測手段［18］。沒有中醫辨證論治與檢驗指標及肝組織病變相關性的研究，無法明確ALD處于哪個發展階段，屬于哪種證型。沒有明確的對照藥物，對不同的證型提供不同的有效對照藥。這些問題造成中藥治療ALD的研究處于較低水平［19］。

因此，養肝活血湯治療ALD，能夠抑制大鼠肝細胞IL－1β和IL－6的表達，為今后的臨床治療提供了實驗基礎。