水稻內生菌研究進展及展望

劉江葦,劉 穎,徐 婷,卜志剛,劉選明,朱詠華

(湖南大學生物學院,中國湖南長沙410082)

水稻作為全球一半以上人口的口糧,是我國乃至全世界最重要的糧食作物之一[1]。隨著全球經濟的迅速發展,人類生活水平的不斷提高,人們對優質稻谷的需求也隨之增加,因此,越來越多的研究者致力于研究和生產品質好與產量高的稻米。而病蟲害如稻飛虱、稻瘟病,氣候變化如缺水、干旱等,都能夠造成稻米減產和品質降低[2～3]。為了緩解這些病害和氣候變化所帶來的不利影響,植物內生菌逐漸進入了研究者的視野。植物內生菌是指全部階段或部分階段生活在健康植物細胞內或細胞間隙的微生物資源[4],它們對宿主植物的作用分為有益、中性和有害3個方面[5]。自從德國植物病理學家De Bary于1866年提出內生菌(endophyte)的概念以來,越來越多的內生菌被研究者們從不同植物的各個組織中分離出來[6]。內生菌不僅能夠通過分泌1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)脫氨酶、植物激素等物質促進植物生長,還可以分泌一些水解酶、抗生素、生物堿等物質幫助植物抵抗病蟲害,使植物在逆境中更好的生存,最終提高水稻的產量和品質,因此內生菌的研究成為了國內外的熱點。

在長期的進化過程中,大部分內生菌與宿主形成了互利互惠的關系,并建立起了復雜又巧妙的互作機制[7]。因此,研究二者之間的互作關系、作用模式與機理,能為我們了解內生菌并加以應用提供理論依據。

目前,研究者們的目光主要集中在內生菌的多樣性及內生菌與宿主植物的互作等方面,本綜述主要對水稻內生菌的多樣性及其與水稻的相互作用進行了概括,并對未來水稻內生菌的研究方向進行展望。

1 水稻內生菌的多樣性

隨著分子生物學技術的發展和檢測手段的不斷提高,微生物檢測的靈敏度越來越高,這使得內生菌的多樣性研究成為內生菌研究領域的重要組成部分。內生菌的多樣性主要表現在分布多樣性和自身種類的多樣性。根據種類的多樣性,內生菌又分為內生細菌、內生真菌與內生放線菌。研究水稻內生菌的多樣性不僅可以解析水稻體內的菌群結構及其變化規律,還能為功能菌株的篩選和應用提供理論依據。

1.1 水稻內生細菌

內生細菌是水稻有益菌的一個重要類群[8],其繁殖速度快,易于培養。目前,關于內生細菌的報道主要是研究不同地區及不同品種水稻體內內生細菌的群落特性。實際上,水稻的種植環境以及生長發育時期都對內生細菌的多樣性有著極其重要的影響[9～10]。Bertani等[8]從淹水和干旱條件下生長的水稻的根、葉、莖中分離得到228株內生細菌,經多樣性分析發現,淹水條件下的水稻相比干旱條件下的水稻體內定殖著更多的內生細菌。Ferrando等[11]發現,在淹水前,水稻根部的內生細菌以β變形桿菌為主,而淹水后的優勢內生細菌則變為γ變形桿菌。內生細菌對水稻的生長發育時期和組織部位也具有選擇性,比如:灌漿時期的水稻內生細菌多于分蘗期和抽穗期[8];相較于根部和莖部,水稻葉部的內生細菌物種最豐富,但參與植物各種代謝調控的細菌主要集中在水稻根部[12]。Rashid等[13]在15種不同的土壤條件下種植同一種番茄,隨后從番茄中分離到了不同類型的內生細菌,進一步證實了內生細菌的多樣性與種植環境有關。此外,植物自身的基因型也能夠影響植物內生細菌的多樣性[14～15]。Walitang等[16]對韓國RDA試驗田中6種不同水稻品種的種子內生菌進行鑒定,發現在相似種植環境下,不同水稻品種種子中的內生細菌的組成取決于水稻自身的基因型。綜上可知,內生細菌的多樣性與多種因素相關。

1.2 水稻內生真菌

1898年,Vogl[17]首次從黑麥中分離出內生真菌,隨后,關于內生真菌的研究在不同領域展開[18～20]。在溫帶地區和熱帶雨林中,大約30萬種陸地植物都是內生真菌的宿主,每一種植物都有1種或多種內生真菌[21]。多數內生真菌隸屬于子囊孢子類(Ascomycetes)。與細菌相比,大多數真菌表現出絲狀的生長習性,這使其能夠采取探索或利用周圍環境的生長策略,形成聚合菌絲的線性器官,從而保護真菌的易位[22]。同時,真菌往往具有堅硬的細胞壁,這使其在惡劣的環境中得以存活。因此,水稻內生真菌也成為發掘微生物資源的熱門領域。水稻內生真菌的分布同樣具有時間和空間的選擇性。Wang等[23]從江西東鄉野生稻中分離出229株內生真菌,其中種子中的內生真菌數量最多,其次為葉、根和莖,表明內生真菌具有組織特異性,且研究者發現它們屬于不同的菌屬。崔凱[24]對水稻根、莖、葉中的內生真菌進行了分析,發現水稻的根部分布有很多的血赤殼屬(Haematonectria)和根盤菌屬(Rhizopycnis),但這兩個菌屬在水稻的莖和葉中幾乎沒有分布;毒麥種子內生真菌屬(Gloeotinia)存在于水稻的莖和葉;念珠菌屬(Candida)只分布在水稻的葉片。這進一步說明內生真菌在水稻體內的分布具有組織特異性。此外,當水稻受到外界脅迫時,其內生菌群落也會發生變化。崔凱[24]利用不同濃度的農藥噻蟲嗪對水稻進行處理,通過多樣性分析發現,水稻在受到農藥脅迫時,其根部的內生真菌多樣性發生了提高,同時高濃度的噻蟲嗪還可以提高水稻莖部和葉部內生真菌的多樣性。

1.3 水稻內生放線菌

最早發現的內生放線菌是能在非豆科植物根部形成根瘤并具有固氮能力的弗蘭克氏菌屬(Frankia)[25]。隨后,研究者們陸續從植物組織中分離出其他種類的內生放線菌,其中大部分屬于鏈霉菌屬(Streptomyces),此外還有諾卡氏菌屬(Nocar-dia)、小雙孢菌屬(Microbispora)、北里孢菌屬(Kitasatospora)等[26]。放線菌是具有經濟價值和生物技術價值的原核生物,它們能夠產生多種生物活性化合物,如抗生素、抗腫瘤藥物和酶抑制劑等,同時它們的絲狀菌絲和產孢特性使其能夠在不利的環境條件下生存且便于開發應用[27],因此分離并利用水稻內生放線菌成為近年來生物防治的熱門領域。

由于放線菌在土壤中的含量非常豐富,所以它們極有可能被水稻的根系分泌物所吸引并進入水稻體內。水稻品種、種植環境、定殖的器官等都可以成為影響水稻內生放線菌分布與定殖的因素。田新莉等[28]對廣東省番禺和五山兩地種植的水稻進行了內生放線菌的分離和鑒定,發現番禺和五山兩地不同的土壤環境導致了水稻內生放線菌種類的不同,且根中的內生放線菌種類較莖和葉多。Jelita[29]對不同生態系統中不同水稻的內生放線菌的種群動態和形態特征進行了評估,發現水稻內生放線菌的種群動態和多樣性受水稻植株的年齡、品種和生態系統類型的影響。以上分析表明,內生放線菌的分布受多種因素的影響。

2 水稻-內生菌的互利共生

內生菌與水稻在長期的共生環境下建立了十分復雜而巧妙的相互聯系,并且通過這些不同方式的相互作用為雙方創造了互利互惠的生長條件。根據作用對象的不同,我們將這些相互作用分為兩種,一種是內生菌對水稻的影響,另一種則是水稻對內生菌的影響。

2.1 內生菌對水稻的影響

2.1.1 固氮作用

氮是葉綠素、氨基酸、含氮雜環堿基(嘌呤和嘧啶)等物質的主要成分,是植物生長和發育必不可少的大量元素之一。水稻的生產高度依賴氮元素,但土壤普遍缺氮的現狀使得生產者必須施用大量氮肥來維持水稻生產,而大量使用氮肥會對環境造成不利影響,因此利用微生物進行的生物固氮吸引了研究者的目光[30]。內生固氮菌是指那些生活在植物體內,并能與宿主植物進行聯合固氮的一類菌群[31]。常見的內生固氮菌有假單胞菌、固氮螺菌、腸桿菌和芽孢桿菌等,這些菌群能夠在寄主植物不形成根瘤結構的前提下,通過自身的代謝系統,利用固氮酶將大氣中游離的N2還原成植物可利用的NH4+,以供寄主植物使用。這類內生菌目前已有很多報道,其中,內生子囊菌被多次提到并證實能夠提高植物氮素養分的吸收并改善寄主植物的生長狀況[32～34]。

截至目前,已有不少具有固氮能力的內生菌被研究者從水稻組織中分離出來。研究報道,在低氮條件下,經過內生真菌Phomopsis liquidambari處理后的水稻的總產量以及氮素利用率相較于未處理的水稻分別提高了12%和11.59%[35];同時,該株內生真菌可以影響水稻根系分泌物的成分,從而調節根際微生物的群落結構[36]。

隨著對內生固氮菌了解的深入,研究者已能夠對水稻組織中原有的內生固氮菌進行基因修飾,以增加水稻自身固氮酶的活性,從而提高水稻的固氮能力[37]。

2.1.2 促生長作用

內生菌能夠促進宿主植物生長的一個主要原因是具有產生植物激素的能力,其中吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)就是一類能夠調節植物細胞伸長、細胞分裂以及根部形成等的天然植物激素[38]。研究人員發現,從水稻中分離得到的洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)RRE25能夠分泌IAA,進而促進水稻的生長,此外該內生菌還能協助宿主水稻提高氮、磷、鉀的吸收效率。為了證實RRE25促生長的能力與IAA的分泌有關,研究人員利用基因改造技術獲得了IAA產量提高數倍的過表達菌株,發現該過表達菌株能幫助水稻吸收更多的營養元素,進而促進水稻的生長和發育[39]。本實驗室前期研究證明,水稻中的氫化鏈霉菌(Streptomyces hydrogenans)OsiLf-2和米修鏈霉菌(Streptomyces misionensis)OsiRt-1不僅可以分泌IAA,還可以分泌其他促生長相關物質,如鐵載體、ACC脫氨酶等,從而促進水稻的生長發育[40～41]。除此之外,內生菌在一定程度上也可以影響水稻自身的激素分泌水平,例如:水稻中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)RWL-1能夠適量提高水稻中赤霉素及水楊酸的產生量,同時抑制茉莉酸和脫落酸的產生量,以促進水稻的生長[42]。相關研究顯示,水稻內生菌的促生長作用與水稻品種無關。例如:經分離自水稻莖部的內生細菌固氮螺菌B510處理的3種不同品種的水稻,均表現出新生葉片生長良好、分蘗數和地上部分的生物量增加、水稻產量顯著提高等現象[43]。

2.1.3 抵抗生物脅迫

生物脅迫是對植物生存與發育不利的各種生物因素的總稱,通常由感染和競爭引起。水稻面臨的生物脅迫主要有稻瘟病、紋枯病、稻白葉枯病等病害以及稻飛虱等蟲害。傳統防治中的農藥不僅會破壞土壤的結構及性質,還會嚴重污染生態環境。因此,采用綠色、安全的微生物農藥來達到防病除蟲的目的,是當今農業生產的發展方向。

紋枯病在我國南方稻區危害嚴重,是當前水稻生產上的主要病害之一[44]。該病由立枯絲核菌引發,多在高溫、高濕條件下發生,發病嚴重時常致葉片發黃枯死,使水稻不能抽穗,或使抽穗水稻的粒重下降。目前已有部分研究報道水稻內生菌能幫助抵御紋枯病,如Shabanamol等[45]從水稻中分離出一株內生固氮芽孢桿菌,該內生菌和傳統殺菌劑多菌靈(Bavistin 50DF)協同處理水稻種子之后,可以誘導水稻產生更多的防御酶,減輕紋枯病的危害,并且內生菌處理后植物的抗病效果比化學殺菌劑更佳。

水稻惡苗病是一種由串珠鐮刀菌引起的系統性侵染的真菌病害。水稻感染惡苗病后,一般不能抽穗或提早抽穗,穗小且結實很少[46]。研究顯示,使用稻生芽孢桿菌(Bacillus oryzicola)YC7007的懸浮液浸泡水稻根部,能夠有效抑制水稻惡苗病的發展;水稻在接種YC7007六個小時后會積累更多的H2O2,同時細胞內的活性氧(reactive oxygen species,ROS)途徑也被激活,表明YC7007能夠啟動水稻體內由ROS介導的防御機制。此外,研究還發現YC7007可以通過激活茉莉酸途徑誘導植物產生針對病原菌的系統抗性[47]。

稻瘟病是由梨孢霉真菌引起的水稻重要病害之一,主要危害葉片、莖稈和穗部,引起水稻的大幅度減產。許多內生菌被報道可以抑制稻瘟病菌的生長,如從大蒜鱗莖中分離出來的內生菌D6、D10、D21和Y3。此外,一些內生菌的無菌發酵濾液也對稻瘟病菌有抑制效果,曾夏冬[40]在掃描電子顯微鏡下觀察到,經過氫化鏈霉菌OsiLf-2發酵液處理的稻瘟病菌菌絲出現畸形和扭曲,這表明該內生菌對稻瘟病菌具有高效的抑制作用。另外,米修鏈霉菌OsiRt-1的發酵液也被證明可以抑制稻瘟病菌菌絲的生長[41]。

稻飛虱是一種對水稻危害較大的害蟲,它主要吸食水稻汁液,導致水稻枯死,倒伏落塘。研究顯示,內生菌可以產生生物堿等物質幫助植物抵抗蟲害。例如:從水稻中分離的內生菌SJ-10可以明顯降低植物中蚜蟲的存活率,促進植物的生長發育[48]。

雖然關于內生菌協助水稻抵御生物脅迫的報道有很多,但目前對于內生菌防治病蟲害的研究尚停留在起步階段。根據現有的報道,水稻內生菌協助宿主水稻抗病的機制主要有分泌抗生物質、重寄生作用、生態位競爭和誘導水稻自身抗性等[49]。一些內生菌可通過多種機制共同作用協助水稻抵抗病害,如本實驗室從水稻中分離得到一株具有良好抗稻瘟病效果的水稻內生菌吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)OsiSh-2,它不僅能夠通過分泌抗生素等次級代謝物質抑制稻瘟病菌的生長,也可通過搶奪鐵元素形成對稻瘟病菌的競爭抑制,更重要的是,它能夠誘導水稻產生系統抗性,從而阻擋稻瘟病菌的入侵[50～52]。因此,在防治水稻病害時,表現出多重機制的內生菌會呈現出更強的效果。

2.1.4 抵御非生物脅迫

近年來,惡劣的環境條件對水稻等作物的危害越來越嚴重,隨著全球極端天氣出現的頻率越來越高,非生物脅迫對農業生產的不利影響日益加劇[53]。因此,越來越多的研究者開始關注如何減緩農作物的非生物脅迫,內生菌則在這方面表現出突出的能力。比如,內生菌可以通過分泌胞外多糖改變植物周圍的土壤結構和多孔性,從而使植物的根部能夠更好地適應含水量變化的環境,進而有利于植物根部在土壤中的伸展[53]。遺憾的是,截至目前,僅有少數報道對內生菌協助宿主水稻抵御非生物脅迫的分子機制進行了研究,且大多還不夠深入。

重金屬污染嚴重影響糧食作物的生長發育,富集大量重金屬的農作物會嚴重威脅人畜生命安全,因此解決重金屬污染的問題刻不容緩。目前,已有文獻報道內生菌能幫助重金屬污染的植物進行生物修復,如Zhou等[55]發現嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R5-5通過下調水稻體內編碼鎘吸收和轉運蛋白的基因的表達,以及改變水稻內生菌的群落結構,顯著降低了水稻植株中的鎘含量。

干旱會影響全球糧食生產,造成糧食產量與質量大打折扣。有研究報道,深色有隔內生真菌(dark septate endophyte,DSE)可以通過降低水稻植株中的氧化應激反應和抗氧化酶的活性,使水稻細胞免受氧化損害,進而增強水稻在缺水條件下的耐受性[56]。

鹽脅迫是最具破壞性的非生物脅迫之一,它會嚴重影響農作物的生長發育,最終導致農作物生產力下降。鹽脅迫會對植物造成多種不可逆的損害,包括:初級和次級代謝活動受損、營養失衡和氣孔導度降低、光合作用受到抑制等。在受到鹽脅迫的后期,植物體內通常還伴隨著離子脅迫和氧化脅迫的發生[57]。因此,內生菌介導的鹽脅迫緩解受到了極大的關注。Sampangi-Ramaiah等[58]從耐鹽的水稻品種中分離出一株鐮刀菌(Fusarium sp.),進一步的研究顯示其能使鹽敏感水稻品種在高鹽環境下健康生長,說明該內生菌能有效提高宿主的耐鹽能力。隨著越來越多的耐鹽內生菌被分離出來,內生菌協助宿主水稻提高耐鹽能力的機制也逐漸被揭示。例如:內生菌中的鏈霉菌(Streptomyces sp.)GMKU 336就是由于具有分泌ACC脫氨酶的能力,所以能夠幫助水稻在高鹽環境下生長[59]。此外,內生菌還可以通過產生IAA、赤霉素、有機酸,或分泌胞外多糖,幫助水稻抵抗鹽脅迫,進而提高水稻的產量。從海稻的根部分離出的內生菌Pantoea alhagi NX-11,由于其能夠產生大量的胞外多糖,所以在水稻受到鹽脅迫時能顯著提高水稻體內丙二醛和脯氨酸的含量,從而提高水稻的耐鹽能力[60]。

2.2 水稻對內生菌的影響

如前文所述,目前大多數研究者都將目光投注于內生菌對水稻的影響。實際上,水稻對寄生在其體內的內生菌也具有一定影響。大量研究表明,水稻會主動改變或控制其體內生態環境,從而達到“選擇”內生菌的目的[61～63]。根系分泌物就是幫助水稻選擇內生菌的有效介質,它不僅僅是根際微生物的重要營養物質,也能夠通過影響土壤微生物的趨化性來調控根際微生物侵染定殖進入水稻的過程[64～66]。比如:水稻的根系分泌物可以吸引固氮弧菌BH72定殖入其根部,且BH72的定殖能夠幫助水稻提高對氮元素及其他營養物質的有效吸收[67];Walitang[68]在對不同水稻品種中的內生菌進行分離鑒定時發現,耐鹽品種中存在大量的黃桿菌屬內生菌,這些黃桿菌屬內生菌具有較高的耐滲透脅迫能力,且在高鹽地區種植的水稻中分布較多,表明內生菌的富集是水稻主動選擇的結果。此外,相關研究報道水稻的代謝物可能影響內生菌的很多生長發育過程,包括鐵螯合、獲取和儲存,群體感應,活性氧解毒,以及其他可能涉及氮循環的生物進程等[69]。

雖然現有研究已證實水稻具有主動選擇內生菌的能力,但是人們對水稻與內生菌之間相互識別的分子機制還知之甚少。兩者在相互識別時,信號如何傳遞？代謝進程在何時發生調整轉換？這些都將是今后需要探究的目標。

3 水稻內生菌的應用前景

3.1 提取天然活性物質

植物與微生物的互作主要通過一些活性次生代謝產物來實現,如微生物產生的抗生素、植物激素及生物堿等物質,它們可以幫助植物抵抗病蟲害,促進植物的生長。水稻內生放線菌被認為是生物活性代謝產物的重要來源[70],它產生的大環內酯類抗生素[71～72]、生物堿[73]和非核糖體多肽[74]等物質在農業中做出了巨大的貢獻。例如:水稻內生菌鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)BCC72023可以產生具有抗細菌和抗真菌活性的大環內酯與聚醚類抗生素,這些代謝產物對成熟辣椒的辣椒炭疽病具有抗性[75]。此外,從內生菌中提取出來的活性物質還可以應用于臨床試驗。Shahzad等[76]從水稻內生的解淀粉芽孢桿菌RWL-1中分離得到了一種化合物,其與從短小芽孢桿菌和鏈格孢菌中分離的抗生素Al77F的化學結構相同,而且對α-葡萄糖苷酶和脲酶具有抑制作用,可以用作具有醫療價值的新型生物活性酶抑制劑。

3.2 制作生物肥料或生物農藥菌劑

微生物肥料是指以微生物的生命活動為核心,使農作物獲得特定的肥料效應的一類肥料制品。相比于傳統的化學肥料,生物肥料具有高效、生產成本低、應用效果好以及環境污染小等優點。Pham等[77]從水稻中分離出來的內生菌固氮施氏假單胞菌A15在溫室條件下能顯著促進水稻幼苗的生長,且促生效果優于化肥,表明該菌有成為生物肥料的潛力。

生物農藥是指利用生物活體或其代謝產物制成的制劑,可以有效地殺滅或抑制農業有害生物。隨著我國農業生產方式的轉變和對環保的極力追求,以及政策方面的大力推動,生物農藥被逐漸重視并廣泛開發。解淀粉芽孢桿菌Y19是一株具有IAA合成能力和固氮解磷活性的玉米內生細菌,蔣曉玲[78]將Y19制作成了微生物肥料,發現該菌肥不僅能夠顯著降低玉米莖腐病的發生(防治效率達到60%以上),而且還能改善玉米根際土壤的微生物區系,提高根際微生物的代謝活性,促進土壤中養分的活化和抑病型土壤的形成,這些功能均表明內生菌在生物農藥方面具有巨大的優勢。

4 內生菌的負面影響

目前,大多數的研究報道主要闡述了內生菌的促生長、抗脅迫等積極作用,然而在某些情況下,內生菌也會對宿主植物產生一些不利的影響。金玲等[79]在對大田小麥苗中的內生菌進行篩選時發現,有6株菌可以引起植株出苗遲、生長緩慢、矮化等現象。Deshmukh等[80]發現內生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)在大麥的根部定殖時,需要其宿主細胞死亡才能夠促進根部的進一步發育。此外,Schulz等[81]認為宿主與內生菌之間存在一種平衡關系,該平衡取決于外界環境和宿主自身。當外界環境等發生改變時,某些內生菌可能會由于無法適應新的環境而對宿主植物產生負面影響。例如:未感染內生真菌的亞利桑那羊茅在營養缺乏的土地上生長時,其長勢好于感染內生真菌的羊茅;但是在營養豐富的土地上,研究者并未觀察到這一現象[82]。因此,我們推測水稻體內可能也存在著某些對其產生負面影響的內生菌。

5 總結與展望

近年來,植物內生菌成為植物和微生物工作者研究的熱點。它在促進水稻生長,幫助水稻固氮,協助水稻抵抗病蟲害,提高水稻對干旱、鹽漬、重金屬等非生物脅迫的耐受力等方面具有獨特的優勢。同時,水稻能主動“選擇”內生菌并通過其分泌的代謝物影響內生菌的許多生長發育過程。但是,目前對內生菌和水稻互作的研究大多集中在生理生化層面和影響因素的探討,分子機理層面的研究較少。此外,已有的研究顯示,部分內生菌在某些情況下會對宿主植物產生負面影響。因此,內生菌和水稻互作的機制以及如何有效地解決內生菌的負面影響將會是未來研究的主流趨勢,更加系統化、全面化地深入研究水稻與內生菌之間的相互關系將對我國農業生產和發展做出巨大的貢獻。