THAP8基因可被HIF-1a上調并促進肺癌細胞活力、克隆形成和侵襲

劉順蓮,寧貽崇,劉凱麗,陳思文,周 琳,李美玲,張 晴,周建林*

(1.湖南師范大學生命科學學院,中國湖南長沙410081;2.湖南師范大學附屬中學博才實驗中學,中國湖南長沙410205;3.崇左市人民醫院檢驗科,中國廣西崇左532200)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤。按組織學類型,肺癌可以分為非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC),其中NSCLC占85%,而NSCLC又可以分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAC)和肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)[1]。肺癌是世界上發病率和死亡率最高的一種惡性腫瘤[2～3]。據統計,我國2015年新發惡性腫瘤392.9萬例,癌癥死亡病例233.8萬例,其中肺癌的新發病例和死亡病例最高,分別占總的新發惡性腫瘤病例和癌癥死亡病例的20.03%(78.7萬)和26.99%(63.1萬)[3]。近年來,隨著分子生物學的發展,靶向藥物的研發取得了較大進展,靶向藥物治療顯著提高了肺癌患者的生存期和生活質量[4]。但是,現有靶向藥物仍然存在耐藥性和靶點少等問題,因此亟需進一步研究肺癌的發病機制,發掘新的靶點。

死亡相關蛋白(Thanatos-associated proteins,THAP)家族因多肽鏈的氨基末端都有1個在進化上高度保守的THAP鋅指結構域而得名,該結構域具有DNA結合活性[5]。另外,THAP結構域的下游還存在1個coiled coil結構域,可以介導同源或異源二聚體的形成[6]。目前,已發現12個THAP家族成員(THAP0～11)[6],其中大部分成員與細胞周期、凋亡和癌癥相關。例如:THAP5在黑色素瘤細胞中起促凋亡的作用[7];THAP7在肺癌組織中高表達,并促進肺癌細胞的增殖[8]。THAP8的功能尚不清楚,目前僅有1篇關于THAP8的報道,該研究發現THAP8在卵巢癌組織中高表達[9]。本文旨在探討THAP8基因在肺癌組織中的表達、轉錄調控和作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RNA提取試劑盒購自上海美吉生物醫藥科技有限公司,反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,熒光定量PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司,熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司,鋪有Matrigel膠的Transwell小室購自美國Corning公司,THAP8抗體購自美國Abgent公司,缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)抗體、ACTB抗體和二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,胎牛血清購買自德國Serana公司,RPMI1640和DMEM培養基購買自美國Gibco公司,轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司,其他常規生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 臨床樣本

肺癌組織和癌旁組織的新鮮樣本來自中南大學湘雅二醫院,樣本的臨床病理資料參見文獻[10]。

1.3 細胞系和細胞培養

正常肺細胞系Beas-2B、6種人肺癌細胞系(95-D、A549、H446、H358、H460 和 H1437)及正常的人類腎上皮細胞HEK293均通過上海鈺博生物科技公司購自美國ATCC公司。細胞培養按ATCC公司提供的說明書進行。

1.4 質粒

熒光素酶(luc)報告基因載體pTAL-luc和β-半乳糖苷酶(lacZ)報告基因載體pCMV-lacZ均購自美國Clontech公司。HIF-1α的表達質粒HAHIF1A為 Kondo等[11]構建(Addgene Plasmid No.18949)。野生型和突變型(野生型中的4個ACGTG序列均突變為AAAAG)啟動子序列(192 bp)由上海生工生物工程股份有限公司合成并克隆到pTAL-luc中,構建的質粒分別命名為THAP8-HRE-luc和 THAP8-mHRE-luc。

1.5 質粒轉染和熒光素酶活性分析

HEK293細胞培養在24孔板中,每個孔分別轉染等量的 pCMV-lacZ(0.2 μg)、THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)以及梯度增加的HAHIF1A(0 μg、0.1 μg、0.2 μg 和 0.4 μg)。每個孔轉染的質粒總量為0.8 μg,不足部分用空載體pcDNA3.1質粒補充。重復3次。轉染24 h后收獲并裂解細胞,按文獻[12]的方法測定半乳糖苷酶活性和熒光素酶活性,并計算熒光素酶活性/半乳糖苷酶活性的比值。

1.6 細胞功能分析

按照文獻[13]的方法進行MTT分析、細胞克隆形成實驗、劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗,所有實驗均重復3次。

1.7 RNA提取、反轉錄和熒光定量PCR

RNA提取和反轉錄按說明書進行操作。以得到的cDNA為模板,采用SYBR Green試劑盒配制反應體系,在ABI 7900 thermocycler(美國ThermoFisher公司)上進行PCR反應。以18S基因作為內參基因,其引物序列:5′-CGGCGACGACCCATTCGAAC-3′和 5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3′,THAP8 基因的引物序列:5′-CCCTGCGCCAACTCCTGAGC-3′和 5′-TGTGGCAGGTGCAGGGTCCT-3′。每組設4個平行反應。PCR程序為95℃預變性5 min,然后進行40個循環,每個循環包括95℃變性30 s,58℃退火30 s,72°C延伸30 s。

1.8 蛋白質免疫印跡(Western-blot)

細胞裂解、電泳和Western-blot按照文獻[13]的方法進行。

1.9 慢病毒感染和穩定細胞篩選

THAP8 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒和陰性對照慢病毒(negative control,NC)購自廣州復能基因有限公司,其干擾靶點序列見表1。HIF-1α過表達慢病毒購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。慢病毒感染和穩定細胞株構建按照文獻[13]的方法進行。

表1 THAP8 shRNA慢病毒和陰性對照慢病毒的干擾靶點序列Table 1 The target sequence of each THAP8 shRNA lentivirus and negative control lentivirus

1.10 統計學分析

利用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 7進行數據統計并繪圖。用Student’s t-檢驗分析兩組間的差異,用P值表示顯著性水平,“*”表示P≤0.05,“**”表示P≤0.01。每組數據都根據 3個或以上的獨立實驗獲得平均值±標準差(±s),當P<0.05時,結果才被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 THAP8在肺癌組織中的表達高于正常肺組織

首先,我們通過UALCAN軟件[14](http://ualcan.path.uab.edu)分析了TCGA數據庫中的RNA-seq數據,發現THAP8在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達顯著高于正常肺組織(圖1A)。然后,我們進一步分析了Oncomine腫瘤芯片數據庫[15]中的數據,其結果(圖1B)與TCGA數據庫的分析結果一致。為了驗證數據庫分析的結果,用熒光定量PCR技術分析了22對人肺癌(其中,腺癌和鱗癌各11對)及癌旁組織樣本,結果表明:肺癌組織中THAP8的mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(圖1C)。Western-blot結果表明:THAP8蛋白在肺癌細胞系中的表達水平明顯高于正常肺細胞系Beas-2B;在6種肺癌細胞系中,H460和H1437的THAP8蛋白表達水平最高,而A549細胞系的THAP8蛋白表達水平最低(圖1D～G)。

圖1 THAP8在肺癌組織中顯著高表達(A～C)在TCGA數據庫(A)、Oncomine數據庫(B)和臨床樣本(C)中分析THAP8 mRNA水平;(D～F)3次重復的免疫印跡實驗;(G)3次免疫印跡實驗的THAP8條帶灰度分析,與Beas-2B相比,ns表示沒有顯著性差異,*表示P≤0.05,**表示P≤0.01。Fig.1 THAP8 is overexpressed in the lung cancer tissues(A～C)Analysis of THAP8 mRNA levels in TCGA database(A),Oncomine database(B)and lung cancer and non-cancerous tissues(C);(D～F)Three repeats of Western-blot experiments;(G)The relative band intensity(mean±standard deviation)of THAP8 protein normalized against that of ACTB.ns:Non-significance,*:P≤0.05,and**:P≤0.01 vs.Beas-2B.

2.2 HIF-1α調控THAP8基因的表達

2.2.1 THAP8基因啟動子上存在HIF-1α的結合位點

JASPAR軟件(http://jaspar.genereg.net)分析顯示,THAP8基因啟動子區含有4個缺氧誘導元件(hypoxia response element,HRE;ACGTG)(圖2A),因此我們推測轉錄因子HIF-1能調控THAP8基因轉錄。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成,其中HIF-1α受缺氧誘導。我們將上述序列及其突變序列(4個ACGTG位點均突變為AAAAG)分別克隆到熒光素酶報告載體pTAL-luc,成功構建THAP8-HRE-luc和THAP8-mHRE-luc的報告質粒。隨后,將THAP8-HRE-luc或THAP8-mHRE-luc分別與HIF-1α表達質粒HA-HIF1A共轉染到HEK293細胞中,24 h后測定熒光素酶活性,結果表明:隨著HA-HIF1A質粒量的增加,THAP8-HRE-luc熒光素酶活性明顯增強,而HA-HIF1A的表達對于突變的THAP8基因啟動子活性則沒有顯著的增強作用(圖2B),這說明:HIF-1α可通過結合到THAP8基因啟動子上的HRE位點,促進THAP8基因的轉錄。

2.2.2 HIF-1α促進THAP8基因的表達

CoCl2可以誘導細胞缺氧從而提高HIF-1α蛋白的表達[16]。我們按照文獻[16]的方法,用不同濃度的CoCl2處理Beas-2B細胞24 h,發現隨著CoCl2濃度的增加,HIF-1α蛋白的表達水平逐漸升高,且THAP8蛋白的表達水平也升高(圖2C),說明HIF-1α能促進THAP8基因的表達。另外,我們將過表達HIF-1α的慢病毒和空載體慢病毒分別感染Beas-2B細胞,72 h之后進行Western-blot分析。結果表明:與未感染慢病毒的細胞(mock組)相比,感染空載體慢病毒的細胞(vector組)中HIF-1α和THAP8蛋白的表達水平都沒有明顯變化,而感染HIF-1α過表達慢病毒(HIF-1α組)之后,細胞中HIF-1α和THAP8蛋白的表達水平顯著升高(圖2D),這進一步說明HIF-1α促進THAP8基因的表達。

圖2 HIF-1α調控THAP8基因的表達(A)THAP8啟動子序列,缺氧誘導元件用下劃線標注;(B)將等量的pCMV-lacZ(0.2 μg)和THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)以及梯度增加的 HA-HIF1A(0 μg、0.1 μg、0.2 μg 和 0.4 μg)轉染 HEK293 細胞,24 h 后測定熒光素酶/β-半乳糖苷酶的相對活性;(C)CoCl2處理Beas-2B細胞增強HIF-1α和THAP8的表達;(D)未感染慢病毒組(mock)、空載體慢病毒感染組(vector)和HIF-1α過表達慢病毒組(HIF-1α)的Western-blot分析。Fig.2 HIF-1α up-regulates the expression of THAP8 gene(A)The sequence of THAP8 promoter.The hypoxia response elements(HREs)are underlined;(B)HEK293 cells were co-transfected with pCMV-lacZ(0.2 μg),THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)and increasing amount of HA-HIF1A(0 μg,0.1 μg,0.2 μg and 0.4 μg).At 24 h post-transfection,the cells were lysed to measure the activities of luciferase and β-galactosidase.The relative luciferase activities were normalized according to β-galactosidase activities;(C)Expression of HIF-1α and THAP8 in Beas-2B induced by CoCl2treatment;(D)Western-blot analysis of mock group(the uninfected Beas-2B cells),vector group(the Beas-2B cells infected with empty vector lentivirus)and HIF-1α group(the Beas-2B cells infected with HIF-1α-overexpressing lentivirus).

2.3 干擾THAP8抑制肺癌細胞的增殖、克隆形成和侵襲

2.3.1 干擾THAP8細胞系的構建

我們構建了4個THAP8 shRNA的表達載體,并將其包裝成慢病毒顆粒(表1);在95-D細胞中進行預實驗以檢測干擾效果,結果顯示sh32和sh33這兩個慢病毒的干擾效果最佳(圖3A),因此在后續實驗中采用這兩個慢病毒對THAP8進行干擾。選取THAP8表達水平相對較高的H460和H1437細胞系做干擾實驗,并構建穩定細胞株。Western-blot證實肺癌細胞系H460和H1437的干擾細胞株構建成功(圖3B～C)。

圖3 干擾THAP8的穩定細胞系的構建(A)表達陰性對照shRNA(NC)或THAP8 shRNA(sh31、sh32、sh33和sh34)的慢病毒分別感染95-D細胞,72 h后收獲細胞進行免疫印跡;(B～C)表達NC、sh32和sh33的慢病毒分別感染H460和H1437細胞后經潮霉素篩選獲得的穩定細胞株的免疫印跡結果。Mock表示未感染慢病毒的細胞。Fig.3 Generation of cell lines stably expressing THAP8 shRNAs(A)The 95-D cells were infected with lentiviral particles expressing scramble shRNA(NC)or THAP8 shRNA(sh31,sh32,sh33,sh34),and were harvested for Western-blot at 72 h after transduction;(B～C)The sh32 and sh33 lentiviral particles were selected to infect H460 and H1437 cells.After infection,the cells were selected for stable cells with hygromycin and subjected for Western-blot.Mock:The cells without lentivirus infection.

2.3.2 干擾THAP8抑制肺癌細胞活力

在構建了干擾THAP8的穩定細胞株后,采用MTT法探討干擾THAP8對肺癌細胞活力的影響。結果表明:與陰性對照NC組相比,從3 d后開始,干擾THAP8的H460細胞的活力顯著降低(圖4A),而在5 d后干擾THAP8的H1437細胞的活力才具有顯著差異(圖4B)。這些結果說明:干擾THAP8能抑制H460和H1437的細胞活力,但其對H460細胞活力的影響大于H1437。

圖4 干擾THAP8對肺癌細胞H460(A)和H1437(B)活力的影響sh32組和NC組比較,*:P≤0.05,**:P≤0.01;sh33組和NC組比較,#:P≤0.05,##:P≤0.01。Fig.4 The influence of THAP8 knockdown on viability of lung cancer cells H460(A)and H1437(B)*:P≤0.05 and**:P≤0.01,sh32 vs.NC;#:P≤0.05 and##:P≤0.01,sh33 vs.NC.

2.3.3 干擾THAP8抑制肺癌細胞的克隆形成能力

細胞克隆形成實驗結果表明,與對照NC組相比,干擾THAP8的H460和H1437細胞的群落顯著減少(圖5),說明THAP8促進肺癌細胞的克隆形成。

圖5 干擾THAP8對肺癌細胞克隆形成能力的影響3次克隆形成重復實驗的代表性圖片(A～B)和克隆數的平均值(C～D);**表示與NC組相比,差異極顯著(P≤0.01)。Fig.5 The influence of THAP8 knockdown on lung cancer cell colony formationRepresentative images of colony(A～B)and the average colony numbers from three repeats of experiments(C～D).**:P≤0.01 vs.NC.

2.3.4 干擾THAP8抑制肺癌細胞的侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果表明,與對照NC組相比,干擾THAP8的H460和H1437的侵襲細胞數量顯著降低(圖6),說明THAP8促進肺癌細胞的侵襲。

圖6 干擾THAP8對肺癌細胞侵襲能力的影響3次Transwell侵襲重復實驗的代表性圖片(A～B)和統計分析結果(C～D);**表示與NC組相比,差異極顯著(P≤0.01)。Fig.6 The influence of THAP8 knockdown on lung cancer cell invasionRepresentative images(A～B)and statistical analysis(C～D)of invaded cells in the Transwell invasion assay.**:P≤0.01 vs.NC.

3 討論

本文通過癌癥數據庫分析和臨床樣本分析均發現,THAP8在肺癌組織中異常高表達(圖1)。這個結果與王冠等[9]的結果類似,他們發現THAP8在卵巢癌組織的表達顯著高于正常卵巢組織。為了研究THAP8在肺癌細胞中的功能,在H460和H1437細胞中干擾THAP8基因,并采用細胞活力實驗(MTT法)、劃痕實驗、克隆形成實驗和侵襲實驗等探究了THAP8對肺癌細胞生物學行為的影響。研究結果表明:干擾THAP8基因之后,H460和H1437細胞的活力、克隆形成和侵襲能力均顯著下降(圖4～6),但其對細胞遷移沒有顯著影響(結果未顯示)。這些結果提示THAP8可能是一個癌基因。

此外,本研究發現THAP8基因啟動子上有4個HRE位點(圖2A),熒光素酶實驗證實HIF-1α可以增強野生型THAP8啟動子活性,但對突變的THAP8啟動子(其4個HRE位點被突變)沒有明顯的影響(圖2B),推斷HIF-1α可以結合到THAP8基因的啟動子上,并促進THAP8基因的轉錄。進一步采用CoCl2誘導處理,使細胞處于缺氧狀態,發現HIF-1α蛋白能調控THAP8基因的表達(圖2C)。而且,在Beas-2B細胞中過表達HIF-1α可以促進THAP8蛋白的表達(圖2D)。

缺氧是實體腫瘤中普遍存在的特征,與腫瘤的轉移密切相關[17]。缺氧會激活HIF-1α的表達,激活的HIF-1α作為轉錄因子發揮作用,調控血管生成和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等相關基因的表達,從而促進腫瘤的EMT和轉移[17～19]。HIF-1α已被證實可以用作治療癌癥的一個靶點[19]。本文發現HIF-1α可以促進THAP8的轉錄,而THAP8可以促進肺癌細胞的轉移,提示HIF-1α可能通過THAP8發揮作用。

綜上所述,本研究發現THAP8是一個新的癌基因,其可以顯著促進肺癌細胞的克隆形成和侵襲,并且其表達受到HIF-1α蛋白的調控。這些結果說明THAP8基因可以作為一個潛在的肺癌治療靶點和預后標志,可為癌癥的診斷、預后判斷和抗腫瘤藥物開發提供新思路。

致謝:本文所用的肺癌組織樣本由中南大學湘雅二醫院胸外科卿蓓博士提供,在此表示感謝！