氫水對高脂高糖飼料喂養大鼠主要臟器和肝損傷的調節作用

李衛霞,陳劍華,郭旭麗,王雪玲,陳天山,劉曉霞*

(1.河北工程大學醫學院,中國河北邯鄲056038;2.中國船舶重工集團公司第七一八研究所,中國河北邯鄲050038;3.河北工程大學附屬醫院,中國河北邯鄲050038)

氫水(hydrogen water,HW),指在不改變原水理化性狀的條件下,通過物理或其他方法加入(溶入)氫氣而制得的水[1]。研究表明,當水中氫氣質量濃度在1.0 μg/mL以上時,能發揮選擇性抗氧化[2]、抵御炎癥和細胞凋亡等作用[3～4],從而保護細胞和組織免受氧化損傷,對糖尿病[5]、癌癥[6]、心肌損傷[7]以及炎癥[8]等具有治療和預防作用。隨著國內外氫水行業的快速發展,氫水的功效研究和醫學應用也逐漸深入。雖然目前認為氫水具有多種治療作用,但作為臨床藥物使用,其對機體主要臟器的影響及作用機制仍不清楚,需進行系統的研究。

本研究通過灌胃方式給高脂高糖飲食大鼠飲用一定量氫水,觀察氫水對高脂高糖飼料喂養組大鼠主要臟器指數、肝臟組織結構、血清轉氨酶以及抗氧化指標的影響,分析氫水對大鼠主要臟器的毒副作用以及對肝損傷的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究使用的儀器主要有BP-100A全自動大小鼠無創血壓測量儀(成都泰盟軟件有限公司)、Agilent-7890A氣相色譜儀(安捷倫公司,美國)、HITACHI 7170A全自動生化分析儀(日立公司,日本)、UV1102紫外-可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)以及iMark全自動酶標儀(Bio-Rad公司,美國)。

血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、谷草轉氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)、谷丙轉氨酶(glutamicpyruvic transaminase,GPT)等檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司,蘇木精-伊紅染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

氫水(H2質量濃度為1.25 μg/mL)源自中國船舶重工集團公司第七一八研究所,基礎飼料購自河北醫科大學實驗動物中心,高脂高糖飼料購自北京博愛港商貿中心(主要組分為65%基礎飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉和1.5%雞蛋麻油花生混合劑)。

1.2 實驗動物

6～8周健康雄性SD大鼠40只,體重(200±20)g,購自河北醫科大學實驗動物中心(動物批號:1702254)。SD大鼠在室溫22～26℃、相對濕度50%～60%的環境下飼養。

1.3 倫理學處理原則

所有動物實驗均經過河北工程大學醫學倫理委員會同意,實驗方法符合動物醫學倫理管理規范。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組和處理

SD大鼠適應性基礎喂養兩周后稱重,并隨機分為4組:高脂高糖飼料+HW組、高脂高糖飼料+ddH2O組、基礎飼料+HW組、基礎飼料+ddH2O組,每組10只。參考王贊等[7]的方法,各組大鼠分別采用氫水或ddH2O灌胃12周,劑量為1.0 mL/100 g體重,早晚各1次,其余時間自由飲水攝食。每天觀察大鼠體重、毛色、飲食、排便及日常活動狀況,并根據體重調整灌胃劑量。

1.4.2 臟器指數檢測

大鼠灌胃12周后,斷頸處死,采集肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胸腺組織,并稱重,按下述公式計算臟器指數:臟器指數=臟器質量/體重×100%。

1.4.3 肝臟組織病理檢測

用生理鹽水沖洗采集的肝臟組織,并切割成1 cm×1 cm的組織塊。組織塊經多聚甲醛固定后,進行常規石蠟切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,最后在顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理改變。

1.4.4 血清轉氨酶活性檢測

大鼠灌胃12周后,斷頸處死,摘眼球法采集血液,室溫靜置2 h,2 500 r/min離心10 min,分離血清。血清中GOT和GPT的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作,采用全自動生化分析儀測定活性。

1.4.5 血清抗氧化指標檢測

血清中 SOD、GSH-Px、MDA、T-AOC、CAT 的檢測嚴格按照南京建成生物工程有限公司提供的試劑盒說明書操作,采用紫外-可見分光光度計測定樣本吸光度,并參照說明書計算SOD、GSHPx、T-AOC、CAT活性和 MDA 含量。

1.4.6 統計學方法

數據采用GraphPad 5.0統計軟件進行處理分析,數據結果以平均值±標準差(±s)表示,組間的樣本比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 飲用氫水對大鼠日常狀況的影響

采用氫水灌胃12周,觀察大鼠毛色、飲食、排便及日常活動狀況,結果顯示:灌胃期間各組大鼠毛色均光滑潤澤,精神活潑;高脂高糖飼料喂養組大鼠的飲食量在前3周稍低于基礎飼料喂養組,之后各組大鼠的進食量、排便及日常活動狀況無明顯差異。

2.2 飲用氫水對大鼠體重的影響

大鼠灌胃12周,每天稱量體重,統計結果顯示:各組大鼠體重均呈穩定增長趨勢,且基礎飼料+ddH2O與基礎飼料+HW喂養組大鼠的體重無顯著差異(n=10,P>0.05);喂養6周后,高脂高糖飼料+ddH2O喂養組大鼠的體重增幅明顯上升,且第8～12周的體重顯著高于基礎飼料組及高脂高糖飼料+HW喂養組(n=10,P<0.05)(圖1)。

2.3 飲用氫水對大鼠主要臟器的影響

灌胃12周后,觀察各組大鼠脾臟及胸腺指數的變化,結果顯示:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,基礎飼料+HW喂養組大鼠的脾臟指數提高53.85%,差異具有顯著性(n=10,P<0.05);與高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠相比,高脂高糖飼料+HW組大鼠的脾臟指數提高66.67%,差異具有顯著性(n=10,P<0.05)(表1);與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,高脂高糖飼料+HW喂養組大鼠的胸腺指數無顯著性差異(n=10,P>0.05),而高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠的胸腺指數降低40.00%,差異具有顯著性(n=10,P<0.05)(表1)。以上數據表明飲用氫水能降低高脂高糖飲食對大鼠免疫系統造成的潛在損傷,從而保護免疫系統功能。

觀察各組大鼠肝臟的外觀,結果顯示:基礎飼料喂養組大鼠肝臟色澤紅潤,外表光滑,包膜結構清晰完整;高脂高糖飼料+ddH2O喂養組大鼠肝臟顏色發白,包膜結構不完整;高脂高糖飼料+HW喂養組大鼠的肝臟顏色、外觀與基礎飼料喂養組大鼠無明顯差異(圖2)。進一步對各組大鼠的肝臟指數進行統計分析,結果顯示:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠的肝臟質量增加18.36%,肝臟指數提高13.67%,差異具有顯著性(n=10,P<0.05);相比于高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠,高脂高糖飼料+HW組大鼠的肝臟質量降低17.69%,肝臟指數降低23.31%,差異均具有顯著性(n=10,P<0.05)(表1)。這些數據表明飲用氫水能緩解高脂高糖飲食對大鼠肝臟造成的損傷,從而保護肝臟功能。

圖2 各組大鼠肝臟顏色及大小比較Fig.2 Comparison of the liver color and size in rats of each group

此外,各組大鼠心臟和腎臟的外觀、質量及臟器指數分析結果顯示:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,基礎飼料+HW組與高脂高糖飼料+HW組大鼠腎臟和心臟的外觀、顏色均未發現明顯變化,相應的臟器質量及臟器指數亦無顯著差異(n=10,P>0.05)(表1),表明飲用氫水對大鼠心臟和腎臟無顯著影響。

表1 各組大鼠臟器質量及指數Table 1 Organ mass and index in rats of each group(±s)

表1 各組大鼠臟器質量及指數Table 1 Organ mass and index in rats of each group(±s)

注:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,aP<0.05;與高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠相比,bP<0.05(n=10)。Notes:aP<0.05,compared with basic diet plus ddH2O group;bP<0.05,compared with high-fat and high-sugar diet plus ddH2O group(n=10).

Groups Thymus mass/g Thymus index/(%)Spleen mass/g Spleen index/(%)Liver mass/g Liver index/(%)Left kidney mass/g Left kidney index/(%)Right kidney mass/g Right kidney index/(%)Heart mass/g Heart index/(%)Basic diet plus ddH2O 0.25±0.07 0.10±0.03 0.54±0.11 0.13±0.07 10.46±0.32 2.34±0.49 1.14±0.25 0.30±0.04 1.04±0.12 0.28±0.14 1.10±0.32 0.27±0.06 Basic diet plus HW 0.23±0.08 0.08±0.06 0.69±0.21 0.20±0.02a 9.69±0.23 2.38±0.56 1.39±0.18 0.37±0.08 1.19±0.31 0.30±0.17 1.15±0.27 0.32±0.10 High-fat and high-sugar diet plus ddH2O 0.16±0.06a 0.06±0.03a 0.46±0.11 0.09±0.02 12.38±0.33a 2.66±0.16a 0.96±0.23 0.23±0.04 1.10±0.24 0.25±0.13 1.04±0.12 0.26±0.14 High-fat and high-sugar diet plus HW 0.21±0.05 0.08±0.04 0.60±0.14 0.15±0.03b 10.19±0.17b 2.04±0.28b 1.08±0.18 0.21±0.10 1.02±0.21 0.22±0.08 1.09±0.15 0.27±0.15

2.4 飲用氫水對大鼠肝臟組織結構的影響

大鼠灌胃12周后,取肝臟組織進行病理顯微觀察,結果顯示:基礎飼料喂養組大鼠肝小葉結構清晰,肝細胞索排列整齊,細胞無明顯病變,核結構清晰;高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠肝小葉分界不清,肝細胞索結構紊亂,肝組織出現明顯的空泡樣變性;高脂高糖飼料+HW組大鼠肝細胞索排列整齊,細胞著色均勻,組織未見明顯空泡現象,與基礎飼料喂養組大鼠無顯著性差異(圖3)。以上信息進一步表明飲用氫水對高脂高糖飲食誘導的大鼠肝損傷有一定保護作用。

圖3 各組大鼠肝臟組織的切片觀察(HE染色)圖中箭頭所指可見肝細胞索結構紊亂,肝組織有明顯空泡樣變性。Fig.3 HE staining of rat liver tissue sectionsThe arrows point the disordered structure of the hepatocellular cord and the apparent vacuolar degeneration in liver tissue.

2.5 飲用氫水對大鼠血清轉氨酶的影響

大鼠喂養至12周后,禁食12 h,摘眼球采血,收集血清,檢測血清中GOT和GPT的活性,結果顯示:與基礎飼料+ddH2O喂養組相比,基礎飼料+HW喂養組大鼠血清中GOT和GPT的活性分別降低9.71%和15.81%,但差異均不具有顯著性(n=10,P>0.05);與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠血清GOT活性提高77.56%,差異具有極顯著性(n=10,P<0.01);與高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠相比,高脂高糖飼料+HW組大鼠GPT、GOT活性分別降低27.04%和44.10%,差異均具有極顯著性(n=10,P<0.01);高脂高糖飼料+HW喂養組與基礎飼料+ddH2O喂養組的轉氨酶活性無顯著性差異(n=10,P>0.05)(表2)。以上數據提示:飲用氫水能降低大鼠血清氨基轉移酶的活力,在一定程度上可緩解高脂高糖飲食對肝臟的損傷作用。

表2 各組大鼠空腹血清GOT和GPT的活性比較Table 2 Comparison of fasting serum GOT and GPT activities in rats of each group(±s)

表2 各組大鼠空腹血清GOT和GPT的活性比較Table 2 Comparison of fasting serum GOT and GPT activities in rats of each group(±s)

注:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,aaP<0.01;與高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠相比,bbP<0.01(n=10)。Notes:aaP<0.01,compared with basic diet plus ddH2O group;bbP<0.01,compared with high-fat and high-sugar diet plus ddH2O group(n=10).

Groups Basic diet plus ddH2O Basic diet plus HW High-fat and high-sugar diet plus ddH2O High-fat and high-sugar diet plus HW Reference range[4]GPT/(U·L-1)68.00±20.05 57.25±16.50 79.50±12.50 58.00±15.50bb 33～98 GOT/(U·L-1)182.75±47.50 165.00±59.50 324.50±72.50aa 181.41±32.50bb 69～322

2.6 飲用氫水對大鼠血清抗氧化指標的影響

大鼠灌胃12周并禁食12 h后,摘眼球采血,收集血清,檢測各組大鼠血清 T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA含量,結果顯示:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,基礎飼料+HW組大鼠血清T-AOC、SOD、CAT的活力水平分別升高22.85%、29.03%和60.80%,差異均具有顯著性(n=10,P<0.05),血清MDA的含量降低36.25%,差異具有極顯著性(n=10,P<0.01),而高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠血清T-AOC、SOD、GSH-Px的活力分別降低35.62%、29.30%和35.25%,差異具有顯著性(n=10,P<0.05),同時MDA含量升高27.31%,差異具有極顯著性(n=10,P<0.01);與高脂高糖飼料+ddH2O組相比,高脂高糖飼料+HW組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT的活力分別升高45.07%、61.11%和89.94%,差異具有極顯著性(n=10,P<0.01),而MDA含量則降低31.00%(n=10,P<0.05),且與基礎飼料+ddH2O組無顯著差異(n=10,P>0.05)(表3)。上述數據表明,飲用氫水能顯著提高高脂高糖飼料喂養大鼠的抗氧化能力,降低脂質過氧化物含量。

3 討論

氫作為一種還原劑,可選擇性地清除活性氧,對癌癥、糖尿病、非酒精性脂肪肝[9]、放射性皮膚損傷[10]等各類疾病均有防護作用。本研究發現,飲用氫水對大鼠體重、飲食、排便等日常生理及活動狀況均無顯著影響,表明氫水對大鼠基本體征和生理狀況無顯著毒副作用,該結果為氫水的應用安全性提供了實驗依據。

臟器質量、臟器指數作為動物實驗中常用的重要基礎數據,在一定程度上可以反映藥物對臟器的影響或損傷程度[11]。胸腺和脾臟作為重要的免疫系統器官,在細胞免疫和體液免疫中有著十分重要的意義,根據實驗動物脾臟和胸腺指數的變化可以判斷藥物對動物免疫系統的影響程度[12]。本研究發現,飲用氫水能提高大鼠脾臟和胸腺指數(表1),提示其在一定程度上能改善大鼠免疫系統,并緩解高脂高糖飲食對免疫系統造成的損傷。

夏超群等[13]研究發現,長期高脂高糖飲食會造成肝臟指數的增加,對肝功能造成損傷。本研究證實,飲用氫水能降低肝臟指數,抑制肝組織空泡樣變性,從而緩解高脂高糖飲食對大鼠肝臟造成的損傷。血清GOT和GPT的水平對肝臟疾病及其發病程度的診斷具有重要意義。徐旭東等[14]研究發現,當肝細胞受到損傷時,相關細胞器遭到破壞,GOT或GPT進入血液,導致血清中GOT、GPT水平升高。本文研究證實,飲用氫水能夠降低高脂高糖喂養大鼠血清GPT和GOT的活力(表2),在一定程度上可緩解高脂高糖飲食造成的肝損傷,從而保護肝臟功能。張景云等[9]研究報道,氫水能夠幫助肝臟清除炎癥壞死細胞,可有效清除惡性自由基,顯著抑制脂質過氧化,減少肝細胞氧化損傷。本研究進一步證實,飲用氫水能提高高脂高糖大鼠血清抗氧化酶活力(表3),推測氫水可通過提高機體的抗氧化作用抑制高脂高糖飲食造成的肝損傷。

表3 各組大鼠血清抗氧化指標的比較Table 3 Comparison of serum antioxidant indexes of rats in each group(±s)

表3 各組大鼠血清抗氧化指標的比較Table 3 Comparison of serum antioxidant indexes of rats in each group(±s)

注:與基礎飼料+ddH2O組大鼠相比,aP<0.05,aaP<0.01;與高脂高糖飼料+ddH2O組大鼠相比,bP<0.05,bbP<0.01(n=10)。Notes:aP<0.05 andaaP<0.01,compared with basic diet plus ddH2O group;bP<0.05 andbbP<0.01,compared with high-fat and high-sugar diet plus ddH2O group(n=10).

Groups T-AOC/(U·mL-1)SOD/(U·mL-1)GSH-Px/U CAT/(U·mL-1)MDA/(nmol·mL-1)Basic diet plus ddH2O 43.29±4.94 317.48±17.21 1.39±0.30 9.26±2.10 83.08±16.63 Basic diet plus HW 53.18±4.72a 409.66±62.10a 1.69±0.40 14.89±3.67a 52.96±8.66aa High-fat and high-sugar diet plus ddH2O 27.87±3.09a 224.45±54.70a 0.90±0.23a 6.36±1.62 105.77±17.83aa High-fat and high-sugar diet plus HW 37.43±7.07 325.61±44.31bb 1.45±0.31bb 12.08±2.57bb 72.98±6.91b

氫水作為一種可再生、高效的新型抗氧化劑,具有廣闊的應用前景。本研究進一步證明氫水在提高機體抗氧化作用水平、保肝護肝方面具有一定的功效,但其對高脂高糖飲食造成肝損傷保護作用的分子機制尚不明確,有待進一步深入研究。

利益聲明:本文全體作者均聲明不存在利益沖突。