妊娠期糖尿病對新生子代大鼠膈肌功能的影響

張瑞麗, 楊筱青, 張曉鴿, 郭華峰, 朱繼紅

（1. 河南省鄭州市婦幼保健院產(chǎn)科，河南 鄭州 450012；2. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，河南 鄭州450000；3. 吉林大學第一醫(yī)院生殖中心，吉林 長春 130021）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次出現(xiàn)糖耐量受損或糖尿病，是臨床上常見的產(chǎn)科疾病［1］。GDM 對母嬰均可造成危害，尤其是在妊娠中晚期，母體內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化引起體內(nèi)各種激素的過多分泌。因此對于GDM 患者，若妊娠期高血糖長期得不到有效控制，母體內(nèi)的高血糖可以通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，導致胎兒體內(nèi)也出現(xiàn)高血糖和高胰島素血癥［2］。胎兒體內(nèi)血糖和胰島素水平升高，導致胎兒對營養(yǎng)物質(zhì)需求增加，進而引起胎兒過度或者異常生長，增加母體的剖腹產(chǎn)率和流產(chǎn)率［3］。已有證據(jù)［4-5］表明：高血糖和高胰島素血癥可引起胎兒心臟超微結(jié)構(gòu)和功能的改變，或誘導骨骼肌出現(xiàn)胰島素抵抗。膈肌是一種特殊的骨骼肌，是人體的主要呼吸肌，貢獻人體70%～85%的呼吸做功。與成年人不同，新生兒的呼吸模式以小潮氣量高呼吸頻率為特點［6］。正常的膈肌功能對新生兒的呼吸過程至關重要；反之，膈肌功能異常會導致呼吸功能不全，潛在性地影響新生兒的呼吸功能。而GDM 對新生子代大鼠膈肌功能的影響尚未見報道。本研究通過構(gòu)建大鼠GDM 模型，觀察新生子代大鼠膈肌收縮力、纖維橫截面積和超微結(jié)構(gòu)的變化，并檢測膈肌組織中氧化應激標志物水平，為研究GDM 對新生子代大鼠膈肌功能的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器8 周齡SPF 級SD 大鼠，雌性50 只，雄性25 只，購自鄭州大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （豫）2017-0001。飼養(yǎng)于溫度約25 ℃、濕度約50%、12 h 晝夜交替的動物房里，自由進食水。鏈脲佐菌素（STZ） 購自美國Sigma 公司，一抗（MY-32、NOQ7.5.4D 和 ab11575） 及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、羰基化蛋白、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT） 檢測試劑盒均購自Abcam（上海）公司，二抗（Alexa Fluor 546 標記的驢抗鼠和Alexa Fluor 488 標記的驢抗山羊抗體）和DAPI 購自賽默飛（上海）公司，K-H 液購自麥凱吉（北京） 公司。血糖儀和試紙購自羅氏診斷（上海）公司，體外肌肉收縮力檢測系統(tǒng)購自奧爾科特（上海）公司。

1.2 大鼠GDM 模型構(gòu)建大鼠GDM 模型構(gòu)建方法參照文獻［7］。實驗開始前3 d，每天記錄大鼠的體質(zhì)量并測量血糖。實驗開始前將體質(zhì)量差異較大和血糖水平異常（7 mmol·L－1以上）大鼠剔除。剩余大鼠按雌雄2∶1 比例進行合籠交配，次日清晨觀察到陰栓即認定交配成功，并標記為妊娠第0 天。將妊娠成功的44 只母鼠隨機分為GDM 組和正常對照組，每組22 只。GDM 組孕鼠于妊娠成功后的12 h 后，單次腹腔注射1% STZ 溶液（35 mg·kg－1），正常對照組孕鼠單次腹腔注射相同劑量的0.1 mmol·L－1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。大鼠妊娠第4 天，經(jīng)眼眶取血，測量空腹血糖水平在11.1 mmol·L－1以 上，隨機血糖 在17.9 mmol·L－1以上，尿糖＞，表明GDM 造模成功。共有18 只大鼠成功構(gòu)建GDM 模型。

1.3 子代大鼠膈肌收縮力測量體外膈肌收縮力的測量參考既往研究［8］。分娩后，從每只母鼠的子代中隨機挑選1 只新生子代大鼠（正常對照組22 只，GDM 組18 只），置于天平上稱質(zhì)量后處死，取出完整膈肌組織并測量濕質(zhì)量。 剪取左側(cè)肋弓下膈肌組織，修剪成5 mm×3 mm 的肌條。固定夾固定肌條兩端，垂直放置于27 ℃、95%O2和5%CO2混合氣體持續(xù)氧合的K-H 液中平衡30 min。在刺激電壓為10 V、波長2 ms 和刺激間隔2 min 條件下不斷調(diào)整肌條的長度，從而獲取肌條的最佳初長度。膈肌的最佳初長度為膈肌在以上刺激條件下達到最大緊張收縮力時的長度。最大緊張收縮力即為最佳初長度下的膈肌收縮力，測量3 次取平均值。將刺激電壓設為15 V，其他條件不變，在最佳初長度下獲取最大強直收縮力，取3 次測量平均值。在其他條件不變的情況下，改變刺激頻率，依次獲取膈肌在20、40、60、80、100 和120 Hz 時的收縮力。在刺激電壓10 V、刺激間隔2 min、波長2 ms、刺激頻率60 Hz、串數(shù)120、串間隔670 ms、刺激時間330 ms 和串長16.5 的條件下行疲勞檢測，獲取第1個和第120個波形的收縮力，2 個波形收縮力減少的百分比即為疲勞指數(shù)。實驗結(jié)束時，測定肌條在最佳初長度下的物理長度（cm）和肌條的濕質(zhì)量（g），按照肌肉密度為1.06 g·cm－3，每個肌條在最佳初長度下的橫截面積（cm2）=濕質(zhì)量/密度/肌條長度。

1.4 子代大鼠膈肌纖維橫截面積測量將取材的子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織用OCT 包埋，冰凍切片機切成8 μm 厚的切片，冰甲醇固定30 s，PBS洗 滌。 MY-32 一 抗、 NOQ7.5.4D 一 抗 和 抗Laminin 抗體按1∶300 比例雙色免疫熒光標記，濕盒中4℃避光過夜。PBS 洗滌，二抗室溫下孵育1 h后，洗滌，加入DAPI，封片。熒光顯微鏡下拍照，隨機選取5 個不同視野，采用ImageJ 軟件計算Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維的橫截面積，每只大鼠至少統(tǒng)計200 條Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維。

1.5 子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)觀察取子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織，部分膈肌沿肌纖維橫切面修剪后用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋后行HE 染色，在普通光學顯微鏡下觀察膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)。部分膈肌用2.5%戊二醛固定處理后，行超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察膈肌超微結(jié)構(gòu)。

1.6 子代大鼠膈肌組織中氧化應激指標檢測稱取取材的子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織50 mg，加入800 μL RIPA 裂解液，冰上勻漿后，采用低溫離心機1 500 r·min－1離心5 min 后提取上清液。根據(jù)檢測試劑盒的說明，采用比色法檢測上清液中的MDA 和羰基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗驗證各組數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況。子代大鼠體質(zhì)量，膈肌濕質(zhì)量，膈肌收縮力，膈肌疲勞指數(shù)，膈肌纖維橫截面積，膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性均符合正態(tài)分布，以表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組子代大鼠體質(zhì)量、膈肌濕質(zhì)量和收縮力GDM 組子代大鼠體質(zhì)量［（8.44±0.11） g］ 和膈肌濕質(zhì)量［（0.45±0.01） g］ 與正常對照組［（8.39±0.10）和（0.44±0.01）g］比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，GDM 組子代大鼠膈肌最大緊張收縮力、最大強直收縮力和不同刺激頻率下的膈肌收縮力均明顯降低（P＜0.05），膈肌疲勞指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 2 組子代大鼠膈肌收縮力和膈肌疲勞指數(shù)Tab.1 Diaphragmatic contractile forces and fatigue indexes of offspring rats in two groups （x±s）

2.2 2組子代大鼠膈肌纖維橫截面積GDM 組子代大鼠Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維橫截面積［（613±85） 和 （1 406±159） μm2］ 較 正 常 對 照 組［（859±107）和（1 748±183）μm2］明顯縮小，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 2 組子代大鼠膈肌纖維免疫熒光檢測結(jié)果（×400）Fig.1 Results of immunofluorescence detection of diaphragm fibers of offspring rats in two groups（×400）

2.3 2 組子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)HE 染色結(jié)果顯示：2 組子代大鼠膈肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、致密，膈肌細胞無明顯腫脹，細胞核染色清晰。見圖2。

透射電鏡下觀察，正常對照組子代大鼠膈肌纖維排列整齊，明暗帶及“Z”線清晰；線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴成隔板狀，清晰可見，排列規(guī)則。GDM 組子代大鼠膈肌纖維排列紊亂，明暗帶及“Z”線模糊或斷裂；線粒體外膜模糊，形態(tài)不規(guī)則，嵴消失呈空泡化，出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。見圖3。

2.4 2 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羥基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性與正常對照組比較，GDM 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平均明顯升高（P＜0.05），SOD 和CAT 活性均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

圖2 2 組子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)(HE,×400)Fig.2 Morphology of diaphragm tissue of offspring rats in two groups(HE, ×400)

圖3 2 組子代大鼠膈肌組織超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructures of diaphragm tissue of offspring rats in two groups

表2 2 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羥基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性Tab.2 Levels of MDA and carbonylated protein and activities of SOD and CAT in diaphragm tissue of offspring rats in two groups (x±s）

3 討 論

本研究結(jié)果表明：GDM 母鼠高血糖狀態(tài)會影響新生子代大鼠的膈肌收縮功能，并引起明顯的形態(tài)學改變。GDM 是產(chǎn)科的常見疾病之一，在我國，GDM 的發(fā)病率為1%～5%。近年來，隨著生活水平的提高和生活習慣的改變，我國GDM 發(fā)病率一直呈上升趨勢［9］。對于孕婦，妊娠期間持續(xù)的高血糖狀態(tài)可能導致母體出現(xiàn)妊高癥、胎膜早破、羊水過多及早產(chǎn)等并發(fā)癥。此外，母體內(nèi)的高血糖可以通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，導致胎兒出現(xiàn)高血糖和繼發(fā)性的高胰島素血癥。胰島素作為胎兒的主要生長激素，過多的胰島素會導致胎兒過度生長［10］。已有證據(jù)［4］表明：高血糖和高胰島素血癥引起胎兒心臟超微結(jié)構(gòu)和功能的改變。膈肌是人體的主要呼吸肌，貢獻人體70%～85%的呼吸做功。新生兒的呼吸頻率為40～60 min－1，遠高于成年人的呼吸頻率（16～24 min－1），因此新生兒在完成通氣性氣體交換的過程中對膈肌的依賴程度遠遠高于成年人。一旦胎兒期間膈肌功能發(fā)育異常，會導致新生兒期出現(xiàn)呼吸功能不全，可能進一步引起缺氧、呼吸衰竭甚至死亡［11］。本研究首次揭示了GDM 對新生子代大鼠的膈肌功能的影響，結(jié)果顯示：妊娠期高血糖狀態(tài)會導致新生子代大鼠的膈肌收縮力降低和膈肌抗疲勞能力下降。肌肉的收縮力與肌纖維的直徑有關［12］。本研究結(jié)果顯示：伴隨膈肌收縮力的降低，妊娠期高血糖狀態(tài)也會導致新生子代大鼠膈肌的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維橫截面積縮小，說明高血糖狀態(tài)會影響胎兒期間膈肌纖維的發(fā)育，導致新生子代膈肌纖維的直徑相對較小，進而影響膈肌的收縮力。肌肉的收縮力與肌小結(jié)的結(jié)構(gòu)有關［13］。本研究進一步觀察子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：妊娠期高血糖不影響膈肌纖維的大體形態(tài)，但可造成膈肌纖維排列紊亂，明暗帶及“Z”線模糊或斷裂，線粒體嵴消失呈空泡化，出現(xiàn)凋亡改變，說明高血糖可直接影響膈肌纖維肌小結(jié)的改變，從而造成膈肌收縮力降低。

目前，臨床研究和動物實驗研究結(jié)果［14-15］均表明：氧化應激水平升高是引起膈肌功能異常的關鍵因素。本研究通過檢測子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平的變化來反映氧化應激水平的高低，結(jié)果顯示：GDM 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平明顯高于正常對照組，說明妊娠期的高血糖狀態(tài)會導致新生子代大鼠膈肌組織高氧化應激水平。而氧化應激引起膈肌收縮力降低的機制，目前普遍認為膈肌中的氧化應激水平的升高通過激活膈肌中一系列蛋白水解酶體系，如蛋白酶（calpain）系統(tǒng)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）系統(tǒng)、溶酶體系統(tǒng)以及泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，共同引起蛋白水解是其主要機制［16-18］。在蛋白水解加強的同時，膈肌的蛋白合成受到部分抑制，導致肌纖維出現(xiàn)萎縮，進而導致膈肌收縮力降低。而正常體內(nèi)活性氧類物質(zhì)的生成和清除處于動態(tài)平衡。氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，氧化權(quán)重加大，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。在氧化權(quán)重加大的同時，抗氧化酶體系，如SOD 和CAT，可以分解活性氧類物質(zhì)以減少氧化應激損傷［19-20］。本研究結(jié)果表明：GDM 組子代大鼠膈肌組織中SOD 和CAT 活性明顯低于正常對照組，說明妊娠期高血糖狀態(tài)會抑制抗氧化酶的活性或?qū)е驴寡趸阁w系的過度消耗。本研究結(jié)果反映了妊娠期母體高血糖狀態(tài)會導致胎兒或新生子代膈肌持續(xù)的氧化氧化應激損傷，而氧化應激損傷可能是導致新生子代膈肌功能異常的原因之一。

綜上所述，GDM 可引起新生子代大鼠膈肌收縮力降低、纖維橫截面積減小和膈肌超微結(jié)構(gòu)的改變，而氧化應激水平升高可能是膈肌功能發(fā)生異常的原因之一。