人源單核細胞增生李斯特菌的基因組進化及耐藥性分析

姚 廣, 陸玉穎, 張慶華, 朱海霞, 陳益偉, 孫 東, 莊 振, 張 峰, 劉 鼎, 宋 治

（中南大學湘雅三醫院神經內科，湖南 長沙 410008）

單 核 細 胞 增 生 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes，LM）是一種廣泛存在于土壤和飼料中的革蘭陽性桿菌，被列為20 世紀90 年代四大食源性疾病致病菌之一。LM 主要通過糞-口途徑感染，還可通過眼及破損皮膚和黏膜進入人體而造成感染［1］。細菌侵入血液后，可通過破壞的血腦屏障導致中樞神經系統感染，引起腦膜炎、腦膜腦炎、腦膿腫或腦積水形成［2-4］。菱腦炎（腦干腦炎）是LM 腦炎的一種特殊形式，主要影響腦干和小腦，是老年人細菌性腦膜腦炎的第三大常見病因，僅次于肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌。全球每年人類感染LM 的發病率為（0.2～7.4）/1 000 000，死亡率達20%～70%。目前，LM 感染已成為世界范圍內一個重要的公共衛生問題［5］，國內具體的發病情況和致死率還未有明確報道。本研究通過探討1 例腦膜炎患者病情迅速進展、治療失敗的原因，闡明LM的基因組特征、功能及耐藥機制，為臨床提高該病早期診斷率和進行有效治療提供參考和依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料患者，男性，51 歲。因發熱、頭痛7 d，加重伴意識障礙2 d，于2017 年8 月9 日入中南大學湘雅三醫院神經內科。既往體健。入院時格拉斯哥昏迷指數（GCS）評分11/15（E3V3M5）。腦脊液細胞學檢查可見胞內革蘭陰性桿菌。入院后予以經驗性美羅培南+萬古霉素+大劑量青霉素治療，癥狀仍進行性加重，入院后第3 天GCS 評分降至6/15（E1V2M3），第5 天突發呼吸驟停、雙瞳散大，予以急診側腦室穿刺后仍搶救無效，最終死亡。

1.2 細菌分離培養取患者腦脊液2 mL，3 000 r·min－1離心沉淀15 min，用移液槍取管底沉淀液放入預先配制的10 mL 無菌李斯增菌肉湯（LB）中，并置于30℃生化培養箱中培養24 h，然后用接種環將LB 增菌液劃線接種于血瓊脂培養基，置于37℃生化培養箱中培養24 h。從血瓊脂平板上挑取菌落進一步行革蘭染色鏡檢和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-FOF-MS）鑒定。菌落革蘭染色：可見成簇的革蘭陽性桿菌，經飛行時間質譜鑒定為LM，藥敏實驗報告對氨芐西林、青霉素和復方新諾明敏感。見圖1。

1.3 菌株基因組提取和全基因測序從該例患者腦脊液中分離得到菌株，常規QIAGEN 試劑盒提取全基因組DNA，安捷倫2100 片段分析系統定量后，按美國illumina 公司基因組測序流程構建基因組文庫，質控后通過Illumina HiSeq 3000 系統進行細菌De novo 測序，對原始數據進行生物信息學分析處理。

1.4 基因組拼接及基因組注釋從原始數據中過濾出低質量數據，進行初始組裝，并通過SOAPdenovo2 獲得連續序列。SSPACE 獲得整段序列，并定位組裝評估基因組質量。比較從美國國家生物技術信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI） 數據庫下載的該物種蛋白質序列信息和BLAST 預測蛋白質編碼基因。用tRNAScan-SE 軟件鑒定轉運核糖核酸（transfer RNA，tRNA） 特征，用RNAmmer 軟件鑒定核糖體RNA。利用基因本體（gene ontology，GO） 數據庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 數據庫對預測基因數據進行功能聚類分析。

1.5 基因組分析與系統進化分析以國際標準LM EDG-e 菌株（NC-u003210.1）為參考基因組，利用BLAST 軟件比較法對38 個菌株和樣品的基因組進行進化分析，用最大似然值構建系統發生樹。

1.6 耐藥基因分析在菌株的基因組上定位了4 個耐藥基因，包括lmo1250（抗生素耐藥蛋白基因）、lmo2355 （多藥耐藥蛋白基因）、lmo1712（多藥耐藥蛋白基因）和lmo0839（四環素耐藥蛋白基因），以細菌基因組序列為基礎，通過單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）定位和分析，并通過數據庫分析該菌株發生的耐藥性突變。

2 結 果

2.1 臨床檢查結果磁共振成像液體衰減反轉恢復 序 列 （fuild attenuated inversion recovery，FLAIR）（圖1A 和B）顯示：患者延髓和中腦有高信號病灶（黑色箭頭），雙側側腦室和第三腦室體積增大，室管膜明顯強化，考慮感染繼發腦積水并間質性腦水腫（白色箭頭）。瑞氏-吉姆薩染色的腦脊液細胞學檢查結果顯示：嗜中性粒細胞比例明顯升高，激活的單核細胞中可見多條胞內桿菌（黑色箭頭，圖1C）。細菌培養可見灰白色、中等大小和半透明的圓形凸起的LM 菌落（圖1D）。將培養的LM 菌落涂片進行革蘭染色，顯示為革蘭陽性桿菌（圖1E）。

2.2 LM 基因組的組裝對培養菌株的基因組進行全長測序，該菌株基因組大小約3 008 507 bp，GC 含量為38.06%，共有31 個scaffolds，命名為XY1803。對基因組質量進行評估后，錯率為0.01% （374 bp）（表1）。 利 用tRNAScan-SE、RNAmmer 和GeneMark 軟件對組裝的基因組進行基因預測，發現了3 001 個蛋白質編碼序列（coding sequences，CDSs），平均長度為300 個氨基酸。3 001 個編碼蛋白序列中有252 種編碼序列，3 種 核糖體RNA （ribosomal RNA，rRNA）和45 種tRNA。

圖1 LM 腦膜炎患者的影像學資料及實驗室檢查結果Fig.1 Imaging and laboratory findings of patient with LM meningitis

表1 細菌基因組測序結果與數據庫中耐藥基因注釋的比較Tab. 1 Comparison of sequencing results of bacterial genome and drug-resistance gene annotation in database

2.3 基因注釋與分析將預測的3 001 個基因與公共數據庫進行比較，并通過KEGG 數據庫聚類分析，結果表明：與LM 基因組一致率為88%，將基因 序 列 分 別 與 SWISS-PROT、 TREMBL、PFAM、NR 和KOG 庫進行比對，取相似度≥30%、e 值≤1e-5 的注釋，合并得到的所有注釋詳細信息。基因的功能類別包括信息儲存與處理、細胞周期與信號傳遞和細胞能量代謝等（圖2）。

圖2 GO 聚類結果Fig.2 Results of GO classification

2.4 基因組學和系統進化分析繼續對培養菌株進行基因組學分析，以國際標準菌株EDG-e 為參考，從NCBI 數據庫中獲得了38 個具有代表性的LM 基因組。系統進化分析表明：數據庫中經典人源LM 標準株EGD-e 和Finland1998 均位于進化譜系Ⅰ中，而EDG-e 屬于實驗室菌株1/2a 血清型；Finland1998 菌株為血清型3a，起源于芬蘭相關疫情；本研究分離的菌株XY1803 與從美國食品加工環境中分離的FSL N1-017 菌株（血清型4b，譜系Ⅱ）和從美國散發的患者中分離的SLCC2540（血清型3b，譜系Ⅱ）基因組進化結構相似（圖3），但基因組序列的一致性也小于88%，約有3 000 bp的基因組序列不一致，認為是系譜Ⅱ中一個新的分型。

圖3 LM 進化圖Fig.3 Evolution of LM

2.5 細菌的耐藥性分析通過對菌株XY1803 基因組3 001 個注釋基因分析，發現了已有報道的耐藥 基 因，包 括 mdtG、 norB、 norC、 lmrP、TC. MATE、 SLC47A、 norM、 mdtK、 dinF、lmrB、mdtG、tetA 和sugE，見表1。在KEGG 聚類分析中，耐藥基因主要參與轉運蛋白活性、質膜和膜的組成部分。細菌基因組中的4 個耐藥基因與EDG-e 基因組進行配對，分別為XY1803-51、XY1803-770、XY1803-2796和XY1803-1997（圖4）。4 個基因長度約1 000 bp，SNP 均小于90%，匹配率 大 于92%。XY1803_51 比 對lmo0519，SNP 為25； XY1803_2796 比 對 lmo1712，SNP 為 53；XY1803_770 比 對lmo1250，SNP 為82；XY1803_1997 比對lmo2355，SNP 為89。

3 討 論

圖4 耐藥基因的突變位點圖Fig.4 Location map of resistance gene mutation

LM 感染被認為是最嚴重的細菌食源性感染之一，一旦累及中樞神經系統，在合理抗感染治療的基礎上其死亡率仍高達30%［6］。因此，在臨床上快速鑒定出菌株類型，結合藥敏結果選擇敏感的抗生素進行及早治療是救治成功的關鍵。然而，對于中樞神經系統LM 感染，腦脊液培養和血培養呈陽性的患者不足50%［7］。培養時間長、陽性率低和藥敏實驗的不確定性是導致中樞神經系統LM 感染患者死亡率和致殘率高的重要原因。通過新一代的測序技術，可以準確、快速（3 d 內）明確病原體類型，并通過準確分析和注釋細菌的基因組［8-11］完成菌株分型和耐藥性分析，從而使及早制定針對性的敏感抗生素治療方案成為可能。

根據細菌基因組的系統進化分析，LM 可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4 個譜系。譜系Ⅰ菌株通常從人類臨床病例中分離出來，其中多數為血清型4b，是LM 感染暴發的主要原因。譜系Ⅱ菌株通常是從食物和環境中分離出來的，血清型以1/2a 為主，主要引起反芻動物感染，極少導致人類致病［12-13］。本研究對該例腦膜炎患者腦脊液中培養的LM 菌株XY1803 進行全基因組測序，結果顯示：該菌株屬于Ⅱ譜系，與SLCC2540 菌的親緣關系更為密切。SLCC2540 菌株已有少量報道能夠導致李斯特菌感染性疾病，本研究結果表明：牧產品食物源性的LM 也具有強烈的人疾病感染性，不能單純依靠血清型分析判斷致病性，需要進行全基因組測序進行病原微生物溯源。

同時，本文作者通過對細菌基因組進行注釋 發 現 MDTG、 NORB、 NORC、 LMRP、TC.MATE、SLC47A、NORM、MDTK、DINF、LMRB、MDTG、TETA 和SUGE 等與耐藥性相關的基因；EggNOG 分類分析結果顯示：上述基因與［P］ ENOG410XNN3 耐藥轉運體emrb-qaca 亞家族、［G］糖轉運和代謝和［P］ENOG410XSK2多藥耐藥蛋白mdtH 等細菌耐藥機制有關聯。在相關基因的KEGG 聚類注釋中，上述耐藥基因與K18926 菌株的ermb、mdth 及DHA2 基因家族、膜鋅組分和轉運體活性有關，分別屬于主要協同轉運蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）轉運體、DHA1 家族和多藥耐藥蛋白［14-15］。MFS是主要的二級膜轉運蛋白超家族，與細胞內外的物質交換和能量代謝有密切關聯。上述耐藥相關基因的發現對于臨床抗感染藥物的選擇具有重要的指導意義。

此外，本研究還預測出與耐藥基因相匹配的基因變異，是量化LM 耐藥程度的一個重要指標。細菌基因組中的4 個耐藥基因SNPs 均小于90%，匹配率大于92%，本文作者認為該菌株具有中度耐藥性，并未發生大范圍的耐藥性基因突變。LM 的胞內特性使其難以有效治療。青霉素、阿莫西林和氨芐西林等能夠與LM 細胞膜上青霉素結合蛋白（penicillin-binding protein，PBP） 中的青霉素結合蛋白3（penicillin-binding protein-3，PBP-3） 高親和力結合，被細胞吸收后儲存在胞質中，從而導致細胞死亡，是臨床一線用藥［16］。復方新諾明、萬古霉素、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和哌拉西林等雖有不同程度耐藥性報道，但也均可作為臨床選擇用藥［16-18］。國內外多項研究［16-19］表明：LM 對四環素、頭孢他啶、頭孢呋辛和頭孢曲松高度耐藥，與LM 細胞膜上PBP 相關結合位點有關。本研究分離得到的XY1803 菌株，在lmo1250（抗生素耐藥蛋白基因）存在25 個耐藥相關突變，變異度相對較小，故對頭孢類抗生素耐藥；但在lmo2355（多藥耐藥蛋白基因）、lmo1712（多藥耐藥蛋白基因）和lmo0839（四環素耐藥蛋白基因）存在較多突變，可以改變細菌耐藥蛋白的編碼，影響耐藥蛋白的結構，故對四環素等其他抗生素耐藥性較低，與臨床藥敏實驗和實際用藥結果相符合。

LM 感染最常見的中樞神經系統表現是腦膜腦炎（70%～97%），菱腦炎少見，大多數成人呈亞急性病程［20］。本例患者感染源于經口攝入病菌（飲用過期牛奶），在不存在任何易感因素（妊娠、糖皮質激素治療、免疫功能受損和年齡等）的情況下，迅速累及中腦和延髓導致呼吸衰竭和腦疝形成，呈現快速進展的暴發性病程，臨床較為罕見。本文作者通過細菌基因組測序分析認為：該菌株可能為新發LM，與以往人源性LM 同源性較低（小于88%），存在大量未知序列；細菌具有相對較強的感染性和侵襲性，并有超過300 個蛋白功能未知。該例患者即使在早期已使用足量、敏感的抗生素仍治療無效死亡，提示傳統的細菌培養和藥敏實驗只能粗略鑒定細菌種類和大致耐藥性，無法對菌株的基因組變異和耐藥性進行全面分析。通過病原體高通量測序的數據比對，可大大提高臨床醫師對感染細菌的全面了解，為感染性疾病的早期診斷和治療方案的制定提供客觀依據，同時加強了對臨床診療的預判性。快速診斷和治療LM 疾病，引入一體化生物信息細菌基因組分析系統和基因組快速測序技術是未來臨床勢在必行的趨勢［9，21］，本研究為此類疾病的診斷、治療及耐藥性分析提供了重要的參考依據。