一株伯克霍爾德菌的鑒定及其對木質素的降解特性研究*

馬英輝 李利軍 盧美歡 仝澤方 吳文朋

(1.陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043；2.西北農林科技大學資源環境學院，農業農村部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西 楊陵 712100)

木質素是由愈創木基、紫丁香基和對羥基苯丙烷3種單體通過醚鍵和碳碳鍵構成的有機聚合物，是構成木質纖維素的主要組分之一，在植物抵御外界入侵的過程中起到重要作用。由于木質素的難降解性，造成了木質纖維素資源不能得到充分利用[1]、造紙過程中形成大量的黑液[2]等問題。微生物對木質素的降解一直是國內外研究人員持續研究的熱點，以往對木質素降解的研究主要集中在白腐真菌上[3]，而由于細菌生長快速、易于大規模培養以及多底物利用等優點，細菌對木質素的降解也被廣泛關注[4]。目前，已有很多文獻研究了細菌對木質素的降解，主要涉及鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)[5]、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[6]、嗜熱菌(Bacillusthermophilus)[7]、叢毛單胞菌(Comamonassp.)[8]、根瘤菌(Rhizobiumsp.)[9]等。

伯克霍爾德菌(Burkholderiasp.)是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細菌，其在環境污染物處理中的作用已有報道[10]。先前的研究已證實伯克霍爾德菌存在胞內類漆酶基因[11]751，但其對木質素的降解特性研究仍相對較少。本研究通過苯胺藍和堿性木質素平板從陜西省某造紙廠污水底泥中篩選一株伯克霍爾德菌(記為菌株BNS)，利用Biolog和16S rRNA對菌株BNS進行鑒定，并對其木質素降解特性進行研究，結果對于闡明伯克霍爾德菌降解木質素的代謝途徑提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

從陜西省某造紙廠污水中過濾提取一定底泥用冰盒冷藏，通過苯胺藍、堿性木質素平板法從底泥中富集篩選獲得一株木質素降解菌，記為菌株BNS。

1.1.2 培養基

無機鹽(MM)培養基：NH4NO32 g，KH2PO40.5 g，Na2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，微量元素液2 mL，制霉菌素(純度≥98%)0.1 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。微量元素液：FeSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.2 g，去離子水定容至1 000 mL。

種子培養基：LB液體培養基。

無特殊說明，所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DHP-300型恒溫培養箱，DHZ-DA型恒溫搖床，ABI 2720型聚合酶鏈式反應(PCR)儀，UV9001型紫外分光光度計，6700F型電子掃描顯微鏡(SEM)，ALPHA型紅外光譜(IR)儀，TGL-18MS冷凍離心機，7890B-7010B型氣相色譜(GC)/質譜(MS)聯用儀，全自動微生物鑒定儀(美國Biolog)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株BNS的生理生化及分子鑒定

將提取的菌株BNS接種于LB液體培養基中，30 ℃、160 r/min下搖瓶活化12 h，得到菌株BNS種子液。取10 mL種子液，在12 000 r/min離心5 min，用無菌去離子水沖洗3次，根據全自動微生物鑒定儀的要求制備IF-A菌懸液。IF-A菌懸液濁度控制在90%～98%，利用8排自動移液器加入到GenⅢ96孔板中，每孔加入120 μL，30 ℃下靜置培養24 h，用于菌株BNS碳源與化學因子代謝的讀板分析。

利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒對菌株BNS進行DNA提取，采用16S rRNA通用引物(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增(94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止反應)，對擴增產物進行測序。在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中進行Blast序列比對后，利用MAGE 5.0軟件采用Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.2.2 菌株BNS降解堿性木質素的影響因素分析

將菌株BNS種子液按0.5%(體積分數，下同)接入含1 000 mg/L堿性木質素的MM培養基中，160 r/min、35 ℃搖床培養60 h。培養過程中，通過調節培養溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)、pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)及添加金屬離子(Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+，添加量均為0.5 mmol/L)，測定堿性木質素降解率變化，分析各因素對菌株BNS降解堿性木質素的影響。

1.2.3 菌株BNS降解堿性木質素的動力學研究

向MM培養基中分別加入堿性木質素100、500、1 000、2 000 mg/L，接入0.5%菌株BNS種子液，在pH 9.0、30 ℃、160 r/min下搖床培養84 h，每隔6 h進行堿性木質素降解率的測定。

采用一級反應動力學對降解數據進行擬合[12]，計算見式(1)：

lnSt=-Ks×t+lnS0

(1)

式中：St為t時刻堿性木質素的質量濃度，mg/L；Ks為一級降解速率常數，h-1；t為降解時間，h；S0為堿性木質素的初始質量濃度，mg/L。

1.2.4 菌株BNS降解堿性木質素的產物分析

對于堿性木質素為1 000 mg/L的降解體系，分別在培養24、48、72 h取10 mL培養液，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液用6 mol/L的鹽酸調pH為2.0，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，加入無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發濃縮至0.5 mL，加入0.1 mL的N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺，60 ℃水浴30 min后用于GC/MS檢測分析。GC參數：DB-5氣相色譜柱，載氣為高純氮氣，恒流1.0 mL/min，進樣體積為1.0 μL，升溫程序為60 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。MS參數：電子轟擊(EI)電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，連接桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描。

1.3 檢測方法

生物量采用烘干法測定，以每升培養液中生物干質量計。采用SEM及IR對菌株BNS降解前后堿性木質素的表面結構及官能團變化進行檢測分析。

2 結果與討論

2.1 菌株BNS的遺傳鑒定

以菌株BNS總DNA為模板，采用通用引物進行PCR擴增，PCR產物測序后獲得1 394個堿基，并在NCBI中進行Blast比對，該菌株16S rRNA序列與洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)相似性達到98%，并根據菌株同源性，選擇了部分模式菌株進行基于16S rRNA的系統進化樹構建。由圖1可見，菌株BNS與洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416進化距離接近，并將該菌株提交GenBank，登錄號為KY681449.1。根據全自動微生物鑒定儀的讀板分析結果，菌株BNS底物廣泛，能夠利用多種常規碳源和有機酸進行生長，且對潔霉素、四環素、利福霉素、萬古霉素以及NaCl等表現出了較強的耐受性，在惡劣環境下具有重要的應用價值。

2.2 菌株BNS降解堿性木質素的影響因素

溫度、pH、金屬離子對菌株BNS降解堿性木質素的影響見圖2。從圖2可以看出，溫度、pH對菌株BNS降解堿性木質素的影響較大，而添加金屬離子對菌株BNS降解堿性木質素的影響相對較小，這是因為溫度、pH主要影響菌株自身的生長情況，而金屬離子影響的是菌株相關代謝產物的形成及活性[13-14]。由圖2(a)可知，在溫度為30～40 ℃時，堿性木質素的降解率基本保持穩定，30 ℃時降解率最高，為52.30%。由圖2(b)可知，在pH為6.0～10.0時，堿性木質素降解率差異不明顯，說明該pH環境適宜菌株BNS生長，其中pH為9.0時堿性木質素降解率最高，為53.88%。在微生物降解體系中加入適量金屬離子能夠顯著增加相關酶的活力[15-16]，由圖2(c)可知，本次研究中0.5 mmol/L的Cu2+、Fe2+都能提高菌株BNS對堿性木質素的降解率，其中Cu2+可使堿性木質素降解率提高近7.0百分點，這是因為Cu2+能夠提高菌株BNS中的漆酶活性[11]752，同理Fe2+也可能增強某種木質素降解酶活性從而提高了菌株BNS對堿性木質素的降解。

2.3 菌株BNS降解堿性木質素的動力學

堿性木質素初始質量濃度分別為100、500、1 000、2 000 mg/L時，菌株BNS連續培養84 h的堿性木質素降解率變化見圖3。由圖3可知，堿性木質素的降解率隨著底物初始濃度的增大而降低，且初始濃度越低，菌株生長的適應期越短，降解率達到穩定的時間越短，這與汪旭暉等[17]采用Logistic模型擬合的氨氮降解動力學相同。初始質量濃度為100 mg/L時，堿性木質素在48 h降解率趨于穩定，達到78.7%；初始質量濃度為500、1 000 mg/L時，堿性木質素在60 h降解率趨于穩定，分別為63.1%、47.2%；初始質量濃度為2 000 mg/L時，堿性木質素降解率一直處于緩慢上升的趨勢，84 h時降解率為39.26%。

對堿性木質素的降解過程進行一級動力學模型擬合，結果見表1。堿性木質素初始質量濃度為100、500、1 000、2 000 mg/L時，擬合模型的相關性系數分別0.937 2、0.939 0、0.915 2、0.975 9，擬合程度較好，說明菌株BNS對100～2 000 mg/L堿性木質素的降解符合一級動力學反應，降解速率常數分別為0.027 3、0.016 6、0.010 6、0.006 5 h-1，菌株BNS對堿性木質素的降解速率隨著底物初始濃度的增大而減小。

2.4 堿性木質素的SEM和IR分析

菌株BNS降解前后堿性木質素的微觀形貌見圖4。可以看出，降解前堿性木質素結構比較致密，表面呈聚合狀態，而經過菌株BNS降解后，堿性木質素表面結構崩解斷裂，呈疏松的顆粒狀。對比可知，菌株BNS能夠對堿性木質素進行解聚，破壞其結構，裂解成顆粒狀，這與張佩佩等[18]采用ComamonasserinivoransC35菌株降解木質素獲得了類似的外觀效果。

圖1 菌株BNS 16S rRNA序列進化關系Fig.1 16S rRNA sequence evolution of strain

圖2 溫度、pH、金屬離子對菌株BNS降解木質素的影響Fig.2 Effect of temperature,pH and metal ions on the degradation of lignin by strain BNS

圖3 菌株BNS對不同初始質量濃度堿性木質素的降解效果Fig.3 Degradation rates of alkaline lignin with different initial mass concentration by strain BNS

表1 菌株BNS對堿性木質素降解的動力學參數

圖4 堿性木質素樣品SEM圖(×700倍)Fig.4 SEM photos of alkaline lignin samples

由圖5可知，堿性木質素經過菌株BNS降解后，1 750、850 cm-1附近處有基團增加，1 560、1 400、1 340、1 100、1 050 cm-1處的基團明顯減少，說明在菌株BNS的作用下，堿性木質素苯環骨架間的C=O、C—H、C—O—C鍵明顯減少，苯環骨架的特征振動區域(1 400～1 600 cm-1)也明顯減弱，苯環結構和以及一些側鏈基團在降解過程中產生了一些變化和修飾[19]。另外，由于苯環骨架的開環，產物中增加了非共軛的羰基、酮基以及苯環之外的C—H基團，也使得產物的反應活性進一步提高，有利于產物進一步降解。

圖5 降解前后堿性木質素的IR對比Fig.5 The IR spectrum of sodium lignosulfonate before and after degradation

2.5 堿性木質素降解中間產物分析

利用GC/MS對堿性木質素降解產物進行檢測，結果見表2。在菌株BNS的作用下，堿性木質素由于解聚降解產生多種特征中間產物，隨著降解的進行，中間產物逐漸被進一步降解產生了更小分子的物質。低分子量的醛和有機酸(香草醛、松伯醛、阿魏酸、香草酸等)等中間產物的產生，表明木質素β-芳基醚鍵和苯環間碳碳鍵的斷裂[20]，乙氧基的產生表明堿性木質素受到菌株過氧化物酶系的作用[21]。

表2 堿性木質素降解過程中產生的中間產物1)

3 結 論

(1) 菌株BNS屬于伯克霍爾德氏菌屬，與洋蔥伯克霍爾德菌16S rRNA序列高度相似，屬于洋蔥伯克霍爾德菌或其亞種。

(2) 菌株BNS對堿性木質素的最佳降解溫度為30 ℃、最佳pH為9.0，堿性木質素降解率最高可達53.88%，0.5 mmol/L的Cu2+、Fe2+能夠提高菌株BNS對堿性木質素的降解；菌株BNS對100～2 000 mg/L堿性木質素的降解過程符合一級反應動力學方程，降解常數在0.006 5～0.027 3 h-1。

(3) 菌株BNS通過自身的過氧化物酶系將堿性木質素的聚合結構裂解，降解主要發生在苯環間的C—C、C—O—C等部位，最終降解產物主要為醛類和有機酸類。