截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠肝細胞進入S期關鍵蛋白的影響*

姜雪嬌 方 嫻 侯偉欣 房 鵬 竇 博 魏曉藝 張秋云

首都醫科大學中醫藥學院 中醫絡病研究北京市重點實驗室 (北京， 100069)

慢加急性肝衰竭(ACLF)有極高的病死率，目前西醫治療強調早期診斷、早期治療、病因治療和綜合治療等，但效果并不理想。截斷逆挽方(JDNW)是全國名中醫錢英教授在姜春華“截斷法”和喻嘉言的“逆流挽舟法”基礎上獨創的臨床應用有效方劑。課題前期對截斷逆挽方的臨床療效和部分療效機制進行了研究，證明了該方能有效改善ACLF大鼠肝功能、減少肝細胞凋亡、促進肝細胞增殖、降低炎癥因子、減少肝細胞損傷[1-6]。肝細胞代償性增殖是肝臟維持自身穩態和產生新肝細胞的主要機制，是肝臟受到損傷后的有效修復方法之一。本實驗將研究截斷逆挽方對ACLF大鼠肝細胞進入S期關鍵蛋白的影響，從加快細胞G1-S期進展、促進肝細胞代償性增殖的角度進一步探明截斷逆挽方對ACLF大鼠的療效機制，為該方臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物材料 Wistar大鼠150只，SPF級，體重(180±20)g，于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購，合格證號: SCXK(京)2012-0001。首都醫科大學動物房飼養，實驗室合格證號:SYXK(京)2005-0022。每籠3只，自由飲食，室溫18～23℃，濕度(50.0±2.0)%，每隔12 h開燈照明。

1.2 藥品 截斷逆挽方(苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草、生黃芪、槲寄生各30 g，三七、莪術各6 g，丹參、生地各20 g，黑附片15 g)，藥材購自北京同仁堂藥店，加水煎煮濃縮至終濃度為4.34 g/ml，4℃保存，使用前水浴加熱。

1.3 主要試劑 人血清白蛋白(A9731-5G，Sigma)；D-氨基半乳糖 (G0500-25G,Sigma)；脂多糖(Sigma，109K4075)；RNA Prep Pure動物組織總RNA 提取試劑盒(離心柱型)(DP431)，TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒(KP104)，Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(FP204)，2×TaqPCR Master Mix(KT201-01)，50 bp DNA Ladder(MD108)，Mark Ⅲ( MD103)，Gene Green核酸染料(RT210)均購自天根生化科技有限公司；RIPA裂解液(C1053,北京普利萊基因技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(P1511,北京普利萊基因技術有限公司)；E2F1(ab179445，abcam), CyclinE(sc-481,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)；β-Actin Antibody(4967,Cell Signaling)。

1.4 主要儀器 1-14高速離心機(Sigma)；Universal 320R低溫離心機(Hettich)；F6/10超細勻漿器 (德國 Fluko公司 )；Model680酶標儀(美國Bio-Rad公司)；165-8003s水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)；170-3930濕轉電轉儀(美國Bio-Rad公司)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(美國LI-COR公司)。

1.5 動物分組及處理 將150只Wistar大鼠隨機分為兩組，正常組(NC)10只、處理組140只，參照劉旭華等[7]ACLF大鼠模型建造方法，對處理組大鼠進行皮下注射人血清白蛋白致敏，取陽性大鼠繼續用HSA進行尾靜脈注射，6周以后取肝纖維化三級以上大鼠繼續注射，再2周以后成模，共成模98只，隨機分為模型組(MC)和截斷逆挽方組(JD)各49只，同時使用D-GalN 400 mg/kg聯合LPS 100 μg/kg腹腔注射進行急性攻擊，建立ACLF模型。采用課題組前期實驗得出的中藥有效劑量2.17 g/(kg·d)，濃度為4.34 g/ml[8]。JD組大鼠于急性攻擊后24 h開始分別給予中藥液連續灌胃5 d、10 d、15 d，正常組和模型組大鼠在相同時間點給予同等劑量的生理鹽水，給藥體積為5 ml/kg，在5 d、10 d、15 d 3個時間點平行取材。將大鼠肝組織，放入-80℃冰箱備用。

1.6 觀察指標與檢測方法

1.6.1 各組大鼠肝臟病理情況 58℃烤石蠟標本載玻片1 h至溶蠟，脫蠟、水化，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)5～10 min，95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)1～3 min， 80%乙醇1 min，蒸餾水1 min。然后進行蘇木精染色5 min，流水稍洗去蘇木精8 s，1%鹽酸乙醇7 s，稍水洗10～30 s，促藍液反藍10～30 s，流水沖洗10～15min，蒸餾水稍洗1～2 s，0.5%伊紅液染色1 min，蒸餾水稍洗1～2 s，80%乙醇稍洗1～2 s，95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)3～5 min，無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)5～10 min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)3～5 min,中性樹脂封片，寫標簽及編號，光鏡下觀察。

1.6.2 實時熒光定量PCR法檢測大鼠肝細胞進入S期的蛋白周期素A、E和Cdc25 根據RNA Pre Pure動物總RNA提取試劑盒的說明進行總RNA提取，使用Model680酶標儀進行濃度和純度檢測，取A260/A280在1.8～2.2的RNA樣品，做下一步實驗。用0.2%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。根據TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。引物序列如下：擴增反應條件為:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火10 s，72℃延伸10 s，共循環40次，4℃保存。以基因β-actin為內參對照，用2-△△Ct(Ct代表循環閾值)表示CyclinA、CyclinE、Cdc25的mRNA相對表達量。

1.6.3 Western blot法檢測肝組織E2F1的表達量 于-80℃冰箱中取出各組大鼠的肝臟組織，置與冰上，進行勻漿，根據蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白濃度檢測、定量，最終定量為3 μg/μl。每支上樣量為5 μl，經10%的SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉40 min至0.22 μm PVDF膜上，后用5%的脫脂奶粉封閉1 h，E2F1抗體(1∶1 000)孵育過夜。TBST洗滌，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，化學成像分析儀上進行條帶分析。以β-actin作為參照，用Image J圖像分析軟件分析目標條帶的灰度值，通過灰度比較的方法來確定目的蛋白相對于內參的表達量，以分析樣本之間的表達量差異。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟病理情況 正常組大鼠肝小葉完整，肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠5 d時可見肝細胞壞死，肝小葉結構模糊，壞死細胞皺縮；10 d時可見壞死區呈帶狀或點灶狀分布，肝組織有明顯炎癥細胞浸潤，肝竇受壓并出血；15 d時可見肝細胞大面積壞死，肝細胞出現水腫變性。JD組大鼠肝細胞炎癥浸潤、出血及壞死程度均較模型組大鼠減輕，在10 d、15 d時改善更明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理圖(HE，×400)

2.2 各組大鼠周期蛋白CyclinA mRNA表達情況 見表1。與正常組相比JD組大鼠CyclinA mRNA表達量均升高，其中10 d、15 d時CyclinA mRNA表達量升高最明顯，差異有統計學意義 (P<0.05)。模型組大鼠各時間點CyclinA mRNA表達量呈逐漸降低趨勢。與模型組比較，JD組大鼠15 d時CyclinA mRNA表達量升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，而10 d時也比模型組對應時間點有所升高，5 d時模型組大鼠其表達量升高更明顯，差異無統計學意義。

表1 各組大鼠CyclinA mRNA相對表達量灰度值比較

2.3 各組大鼠周期蛋白Cdc25 mRNA表達情況 見表2。JD組大鼠Cdc25 mRNA的表達量呈逐漸上升趨勢，與正常組相比，JD組大鼠10 d、15 d時Cdc25 mRNA的表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且15 d時差異最明顯。與模型組比較，JD組大鼠3個時間點均有升高趨勢，但差異無統計學意義。

表2 各組大鼠Cdc25 mRNA相對表達量灰度值比較

2.4 各組大鼠周期蛋白CyclinE mRNA表達情況 見表3。JD組大鼠CyclinE mRNA相對表達量在5 d、10 d、15 d時呈逐漸上升趨勢，且15 d時最為顯著。與正常組比較，JD組大鼠10 d、15 d時升高明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，JD組大鼠在10 d、15 d時升高明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)，5 d時有一定的升高趨勢，但差異無統計學意義。

表3 各組大鼠CyclinE mRNA相對表達量灰度值比較

2.5 各組大鼠轉錄因子E2F1表達及蛋白電泳情況 見表4、圖2。與正常組比較，模型組大鼠在第5天時E2F1表達量最高，但差異無統計學意義。JD組與正常組比較，3個時間點均明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，且在第10天時差異最顯著。與模型組比較JD組大鼠3個時間點E2F1表達量明顯增高，且第10天時差異最為顯著(P<0.05)。

圖2 各組大鼠肝組織E2F1蛋白表達免疫印跡電泳圖

表4 各組大鼠E2F1相對表達量灰度值比較

3 討論

ACLF的發病機制十分復雜，而肝細胞代償性增殖下降是ACLF發生的主要機制之一。眾多研究表明細胞周期狀態可以決定細胞命運，包括靜止期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)[9-13]。其中G1-S為細胞生長期調節的關鍵節點[9]。有研究表明E2F1作為重要的細胞周期調控因子，與pRb一起調控細胞由G1期向S期的過渡[14]，而Cyclin家族是細胞周期中G1期必不可少的蛋白周期素，是G1期向S期過渡的重要激酶，可促使細胞周期中的G1期向S期發展，安全通過DNA損傷檢查點，確保細胞進行分裂。因此通過對細胞周期蛋白進行調控，能夠刺激細胞增殖，延緩ACLF的進展。

肝細胞代償性增殖是肝臟在受到損傷時出現的再生過程，中藥調控肝再生是其治療肝病的重要手段之一。研究表明一些清熱利濕解毒和扶正的中藥都具有促進肝細胞再生的能力。李天興等[15]在切除左葉和中葉肝臟的大鼠身上發現，大黃能夠明顯促進肝再生過程中CycinD1 mRNA的表達量，促進切除術后大鼠的肝再生能力。同時大黃還具有改善爆發性肝衰竭大鼠肝功能和促進肝細胞增殖及再生的作用[16]。解毒化瘀顆粒(茵陳、白花蛇舌草各30 g，赤芍50 g，大黃、郁金、石菖蒲各15 g)在爆發性肝衰竭大鼠模型中能夠對NO-cGMP信號轉導通路進行調控[17]，通過上調NR1和iNOSmRNA的表達量，促進肝細胞再生。清肝方(茵陳、敗醬草、黃芩、虎杖、生大黃、赤芍)可以顯著減輕D-氨基半乳糖誘導的急性肝衰竭大鼠肝細胞的損傷[18]，增強其肝細胞再生能力，其原因可能是通過上調肝組織PCNA的表達，促進肝干細胞的分化。三黃茵赤湯(大黃、茵陳、黃芪、赤芍、姜黃)可以通過抗氧化應激有效減少肝細胞凋亡[19]，促進肝細胞再生。扶正化瘀方(丹參、蟲草菌絲、桃仁、五味子、松花粉和絞股藍)可以上調肝切除術后肝組織CyclinD1的表達，從而促進肝再生。此外丹參的提取物——丹參酮已經被證明可以抑制肝損傷小鼠的ALT、AST水平，并上調肝組織中的CyclinD1的水平,具有明顯促進肝再生的作用[20]。本實驗中所用的截斷逆挽方將清熱解毒、通腑攻下、涼血化瘀與扶正固本的藥物相結合，其中苦味葉下珠、金錢草、瓜蔞清熱解毒，滌痰化瘀，利濕退黃；生黃芪、槲寄生滋補肝腎，和血調肝。三七、生地、黑附片調補陰陽；丹參、莪術化瘀解毒通絡。針對正邪交織、毒瘀虛并存的特點，將祛邪與扶正二者同時并用，能夠有效地減輕患者的臨床癥狀，延緩肝衰竭的進程，在臨床上取得顯著療效[21]。

本實驗結果表明，JD組大鼠肝組織炎癥浸潤、出血和壞死程度明顯減輕；治療5 d時，除CyclinA外，E2F1及CyclinE、Cdc25等周期蛋白的表達量模型組低于JD組，治療10 d、15 d時，E2F1及CyclinE、CyclinA、Cdc25表達量均較同時間模型組均有不同程度上調，并且其上調程度隨著中藥干預時間的延長而上升，其原因可能是肝臟受到急性攻擊后，出現肝細胞代償性增殖，在進行中藥干預后CyclinE、CyclinA、Cdc25表達量增加，通過E2F1介導的細胞信號通路，使E2F1脫離磷酸化的pRb，激活自身轉錄活性，啟動并加快了DNA的生物合成，使細胞能夠通過G1-S的DNA損傷檢查點，使細胞快速進入S期，細胞開始分裂活動，加快肝細胞代償性增殖再生，從而減輕ACLF肝臟的病理損傷。